Gli autori ringraziano Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab e Marie Claire Pflimlin da Roche e Tifany Schaer e Deborah Paolucci da HiQScreen per la loro eccellente assistenza tecnica.

Xenopus laevis sono ospitato e gestito secondo le direttive di animale del Canton Ginevra.
1. Radioligand Binding
<ol><li>
Preparazione del piatto dosaggio
	<ol>
<li>Preparare 1,5 L di tampone di dosaggio con 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl e 15 mM Tris; regolare il pH con HCl a 7,4.</li>
		<li>Preparare i composti da sottoporre a 50.76 µM (ad es., un composto a 10 mM in un 980 µ l di tampone di dosaggio in una microcentrifuga 5 µ l). Mescolare bene usando una macchina vortice ad alta velocità per 2 – 5 s.</li>
		<li>Preparare una pre-diluizione del flumazenil composto di riferimento di pipettaggio 1 µ l del composto (10 mM) a 1.970 µ l di tampone di dosaggio. Mescolare bene usando una macchina vortice ad alta velocità per 2 – 5 s.</li>
		<li>Diluire una soluzione di riserva di flumazenil [3H] con il tampone di dosaggio a 4 ° C a 4 nM in un tubo in polipropilene da 50 mL.</li>
		<li>Pipettare 50 µ l/pozzetto di tampone del saggio nelle colonne 1 e 3 – 11 di una micropiastra a 96 pozzetti come mostrato nel layout della piastra rappresentato nella Figura 2.</li>
		<li>73,2 µ l dei composti diluito a 50.76 µM (Vedi punto 1.1.2) nella colonna 12 della piastra.</li>
		<li>Diluire ciascun composto, utilizzando una progressione geometrica sopra 9 gradini (1E-10 – 1E–06 M), con un 23,12 µ l di trasferimento e riempire colonne 3 – 11. Mescolare accuratamente la diluizione. Cambiare la punta dopo ogni diluizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluire le membrane cellulari
	<ol>
<li>Scongelare le membrane delle cellule precedentemente isolate da un overesprimenti HEK293 umano del recettore GABAA (0.025 – 0,15 mg/mL) per ottenere 80 mL a temperatura ambiente (TA) e trasferire la sospensione nel buffer di dosaggio a 4 ° C.</li>
		<li>Risospendere la soluzione di membrana ancora a 4 ° C con un omogeneizzatore del tessuto per 30 – 40 s a 10.000-12.000 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluire il diazepam per il controllo di legame aspecifico (NSB)
	<ol>
<li>Diluire una soluzione di riserva di diazepam 4 mM con il tampone di dosaggio ad una concentrazione di 40 µM in 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Avviare la reazione
	<ol>
<li>Pipettare 50 µ l di 4 nM [3H] flumazenil in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti e conservarla in un contenitore di acqua ghiacciata.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l della preparazione di membrane sottotipo recettoriale GABAA per avere una concentrazione di proteina di 0,5 mg/mL.</li>
		<li>Pipettare 50 µ l di diazepam di 40 µM nella colonna 2.</li>
		<li>Incubare la piastra per 1h sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di tampone di dosaggio in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti filtro di separazione a membrana successive e misura di radioattività e interrompere la reazione in seguito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fermare la reazione
	<ol>
<li>Preparare un tampone di lavaggio con 50 mM Tris-HCl, pH 7.4.</li>
		<li>Filtrare la soluzione mediante un harvester cella 96 pozzetti. Lavare la piastra 3 x con 300 µ l di tampone di lavaggio ghiacciata per pozzetto.</li>
		<li>Sigillare il fondo del piatto con una pellicola di plastica e aggiungere 40 µ l di cocktail per il liquido di scintillazione scintillazione contando ogni bene e pulire con etanolo 70%.</li>
		<li>Scuotere delicatamente la piastra per almeno 1 h a TA. Lasciate riposare per almeno un'altra ora a TA.</li>
		<li>Misurare la radioattività (in CPM) inserendo la piastra su un contatore di scintillazione. Consentire una misurazione per 3 min per pozzetto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi dei dati
	<ol>
<li>Determinare che la media per le 8 replica di legame aspecifico (NSB) e l'associazione totale (TB) come pure per quanto riguarda i duplicati o triplici copie dei campioni. Calcolare il legame specifico % (SB) per la media di ogni campione secondo la seguente equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Qui, totale SB = la media TB meno il dire NSB.</li>
		<li>Trama in ascissa il SB % versus in ordinata le concentrazioni dell'inibitore. Inserire i dati utilizzando l'equazione di analisi concorrenza singolo sito: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Qui, y = la % di SB, A = minimo di y, B = il numero massimo di y, C = la IC50, X = il log10 della concentrazione del composto concorrente, D = la pendenza della curva (un coefficiente di Hill).</li>
		<li>Calcolare l'affinità di legame (Ki) usando la mezza concentrazione inibitoria massima (IC50), la costante di dissociazione (Kd) di flumazenil [3H] sulle rispettive membrane9e la concentrazione di [3H] Flumazenil nell'analisi secondo la seguente equazione utilizzando dati: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. recettore espressione e registrazioni in ovociti di Xenopus
<ol><li>Ovaie di raccolta e preparazione degli ovociti
	<ol>
<li>Preparare la soluzione sterile di Barth con 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7h2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4h2O e 0,41 mM CaCl2.6h2O, a pH 7,4 , completati con 100 unità/mL di penicillina, 100 µ g/mL streptomicina e 0,25 µ g/mL di amfotericina b.</li>
		<li>Preparare il supporto di x OR2 1 (nessun CaCl2) con 88,5 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6h2O, a pH 7,4.</li>
		<li>Sacrificio una Xenopus Laevis femmina di anestesia profonda per 20 min in raffreddato Tricaina metansolfonato (ad una concentrazione di 150 mg/L, regolata a pH 7,4) e bicarbonato di sodio (300 mg/L) seguita dalla decapitazione.</li>
		<li>Raccogliere le ovaie rapidamente con pinze e forbici pulite e metterli in 2 di-Petri (10cm) riempito con 40 mL di soluzione di Barth e antibiotici/antimicotici: 1x.</li>
		<li>Conservare le ovaie non dissociato per fino a 2 settimane in soluzione di Barth a 4 ° C.</li>
		<li>Per la dissociazione, tagliare le ovaie con una lama di rasoio pulita in piccole frazioni (1 – 2 cm3) e incubare li in 50 mL di mezzo di OR2 senza CaCl2 (OR2-noCaCl2) contenente collagenasi di 0,2% (tipo I) alle 17 – 19 ° C in un filatore di 100 mL matraccio con un'agitazione lenta per 4 – 5 h. Verificare che la barra magnetica è posto circa 3 – 5 cm sopra il fondo del matraccio spinner per evitare di schiacciare gli ovociti.</li>
		<li>Dopo 4 – 5 h, verificare che la maggior parte degli ovociti sono liberata dal loro follicolo (cioè, che nuotano intorno individualmente). Lavare 5X con 200 mL di OR2 completati con 1,8 mM CaCl2.</li>
		<li>Trasferire la defolliculated ovociti di Petri (10cm) riempito con soluzione di Barth e antibiotici/antimicotici e tenerli almeno una notte a 17 ° C prima dell'iniezione di cDNA o mRNA.</li>
		<li>Il giorno successivo, seleziona, sotto un binocolo, un ovocita sano che presenta una chiara e distinta animale contro un palo vegetal (marrone scuro per il polo animale contro giallo chiaro per il palo vegetal). Utilizzare pipette Pasteur pulite e gettare gli ovociti uno per uno in una piastra ben di 96-iniezione conica sterile. Nota: non è richiesta nessuna particolare attenzione nel posizionamento degli ovociti per le iniezioni di mRNA; considerando che, per le iniezioni di cDNA, è indispensabile per orientare gli ovociti con il polo animale rivolto verso l'alto.</li>
	</ol></li>
	<li>iniezione automatica mRNA o del cDNA
	<ol>
<li>Sintetizzare i mRNAs utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo le istruzioni consigliate. Pulire gli strumenti e la tabella con RNAsi e indossare i guanti di protezione appropriati. Nota: La qualità del mRNA è determinante per ottenere una buona espressione, ed è indispensabile per evitare la degradazione di mRNA durante la procedura di iniezione.</li>
		<li>Preparare i cDNAs utilizzando un kit disponibile in commercio e sciogliere la quantità desiderata in acqua bidistillata ad una concentrazione di 0,2 µ g / µ l.</li>
		<li>Iniettare 10 – 50 nL di soluzione di mRNA ad una concentrazione di 0,2 µ g / µ l, o 10 nL di cDNA soluzione ad una concentrazione da 0,02 – 0,2 µ g / µ l, preferibilmente in lotti di 95 ovociti.</li>
		<li>Per membrana proteine che richiedono più subunità (cioè, i recettori eteromerici α1β2γ2 GABAA ), mescolare il corrispondente mRNA o cDNAs nel rapporto desiderato (cioè, 1:1:1 o 1:10:1).</li>
		<li>Mantenere l'ovocita a 17 ° C al fine di prevenire l'espressione di heat shock proteins gli ovociti; conservare la micropiastra in un'area di deposito termo-controllata.</li>
		<li>Sciogliere i residui della prova che erano risultati positivi nel test associazione a OR2 a 0,1 – 1.000 µM per registrazioni elettrofisiologiche e li smaltire in una lastra in polipropilene fondo piatto 96 pozzetti.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmidi per l'espressione
	<ol>
<li>Seguire i manuali di istruzioni dei kit disponibili in commercio per la sintesi di mRNA con promotori batterici T7 o T6 e fare 20 µ l di una soluzione a 0,2 µ g / µ l in acqua RNAsi-libera.</li>
		<li>Preparare almeno 20 µ l di una soluzione contenente un vettore di espressione dell'eucariota per l'espressione di cDNA, in genere a 0,2 µ g / µ l, disciolto in acqua bidistillata.</li>
	</ol></li>
	<li>Microiniezione nell'ovocita e la visualizzazione della sua qualità
	<ol>
<li>Iniettare 10 – 50 nL di soluzione contengono il plasmide (Vedi punto 2.3.1 o 2.3.2) utilizzando un ago di micro-iniezione di vetro con un diametro di punta che vanno fino a 100 µm montata su un micromanipolatore equipaggiato con un sistema di espulsione di pressione o con un sistema automatizzato ad iniezione. Nota: Nell'esempio discusso qui, gli ovociti vengono iniettati con i lotti di 95 con un sistema automatizzato adatto ad uso con cDNA o mRNA.</li>
		<li>Riempire l'ago per iniezione con 1 µ l di un colorante come il blu di metilene all'1% e iniettare gli ovociti mediante la procedura standard (sia nel nucleo per cDNA o nel citoplasma per mRNA).</li>
		<li>Smaltire gli ovociti iniettati per circa 1 minuto in acqua bollente. Tagliare gli ovociti a metà con una lama di rasoio sotto un binocolo. Nota: Il colorante rimane localizzato come mostrato in Figura 3E, permettendo un'osservazione precisa dell'iniezione.</li>
	</ol></li>
	<li>Registrazioni di due elettrodi tensione morsetto
	<ol>
<li>Posizionare la piastra ben contenente gli ovociti sul sistema automatizzato, che utilizza il principio illustrato nella Figura 4. Nota: In contrasto con il sistema del morsetto di patch illustrato nella Figura 5, il potenziale di membrana vero della cella viene letto tramite l'elettrodo di tensione.</li>
		<li>Programmare il sistema di registrazione automatizzata utilizzando l'interfaccia basata su icone con, ad esempio, lo schema illustrato nella Figura 6 per la determinazione del rapporto di attività di concentrazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Adattamento alla curva
	<ol>
<li>Analizzare i risultati utilizzando il software appropriato, utilizzando la curva di attivazione illustrato concentrazione, trama l'ampiezza corrente in funzione del logaritmo della concentrazione dell'agonista.</li>
		<li>Osservare la curva sigmoidale che può successivamente essere equipaggiata con l'equazione empirica di collina nel modulo: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Qui, Y= la frazione di corrente evocati, CE 50 = la concentrazione per un 50% di attivazione, x = la concentrazione del composto, nH = il coefficiente di Hill o la cooperatività apparente.</li>
		<li>Normalizzare le correnti ad un'unità dividendo l'ampiezza di ogni risposta contro il valore registrato al più alta concentrazione di analizzare i dati ottenuti da una serie di celle.</li>
		<li>Determinare la media e gli errori standard e realizzare l'adattamento delle curve utilizzando software come standard disponibili.</li>
	</ol></li>
</ol>3. elettrofisiologiche registrazioni nelle fette del cervello
Nota: Fette Hippocampal del ratto sono preparati in conformità con le linee guida nazionali e istituzionali.
<ol><li>
Preparazione delle fette dell'ippocampo
	<ol>
<li>Preparare il liquido cerebro-spinale artificiale dissezione (dACSF) con 124 mM NaCl 124, 2,5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2mm MgSO4.7h2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26mm NaHCO3, glucosio di 10 mM e 4 mM saccarosio gassificato in bottiglia con una miscela di 95% O2 e 5% CO2.</li>
		<li>Preparare il registrazione fluido cerebro-spinale artificiale (rACSF) con 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2mm MgSO4.7h2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25mm NaHCO3e 10 millimetri di glucosio gassificato in bottiglia con una miscela di 95% O2 e 5% CO2.</li>
		<li>Anestetizzare i ratti utilizzando una miscela di 2,5% isoflurane e ossigeno puro e decapitare loro.</li>
		<li>Tagliare il cuoio capelluto seguendo la linea mediana con un bel paio di forbici. Tagliare il cranio lungo la linea mediana senza danneggiare il tessuto sottostante. Rimuovere il cranio con le pinzette e utilizzare una spatola fine per scavare il cervello.</li>
		<li>Posizionare il cervello nella soluzione dACSF gasati a RT e sezionare la formazione hippocampal di sinistra con una spatola fine.</li>
		<li>Tagliare in sezioni trasversali (spessore 400 µm) dalla parte media dell'ippocampo con un elicottero di tessuto e trasferirli alla camera di registrazione con l'uso di un pennello di pittura. Mantenere le fette a RT per 45 min.</li>
		<li>Irrorare le fette con la rACSF gasati a 35 ° C e a una velocità di 1,5 mL/min bolla la soluzione con una miscela di 95% O2 e 5% CO2. Nota: Dopo questo passaggio, le fette sono pronte per gli esperimenti elettrofisiologici.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Registrazione di spike singola popolazione
	<ol>
<li>Mettete una fetta di cervello nella camera microscopio-montato.</li>
		<li>Irrorare la fetta a una velocità di 3 mL/min con rACSF.</li>
		<li>Tirare una micropipetta di vetro borosilicato con l'estrattore di pipetta avendo una resistenza di MΩ ~ 2. Nota: Questa micropipetta è usata come un elettrodo di registrazione e viene collegata elettricamente all'amplificatore.</li>
		<li>Riempire la micropipetta con una soluzione contenente 2 M NaCl e inserirlo nel supporto pipetta dell'amplificatore.</li>
		<li>Posizione la micropipetta di registrazione nel pyramidale corneum nella regione CA1 di fettine di ippocampo utilizzando il micromanipolatore giusto. Nota: Il percorso è rappresentato schematicamente nella Figura 7.</li>
		<li>Posizionare un elettrodo di platino/iridio bipolare isolato nel supporto sul micromanipolatore di sinistra. Nota: Questo elettrodo viene utilizzato come l'elettrodo di stimolazione ed è collegato elettricamente al generatore di stimolo.</li>
		<li>Posizionare l'elettrodo di stimolazione nei collaterali di Schaffer nella regione CA1 della fetta hippocampal utilizzando il micromanipolatore giusto. Nota: Il percorso è rappresentato schematicamente nella Figura 7.</li>
		<li>Fornire un impulso di corrente all'elettrodo di stimolazione utilizzando il generatore di stimolo ogni 30 s (durate 100 µs, a partire da 10 µA) e aumentare gradualmente l'intensità di stimolazione fino a un picco di popolazione (PS) viene visualizzato.</li>
		<li>Regolare l'intensità di stimolo per evocare un PS corrispondente al 45% dell'ampiezza massima che può essere ottenuta. PSs sono filtrati a 2,4 KHz e digitalizzati a 20 KHz utilizzando l'amplificatore di segnale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inibizione di accoppiare-impulso
	<ol>
<li>Preparare le fettine di cervello (punto 3.1) e procedere come descritto in precedenza (punti 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Fornire due impulsi di corrente (100 µs durate a un intervallo di 20 ms) all'elettrodo di stimolazione ogni 30 s utilizzando il generatore di stimolo. Regolare l'intensità di stimolo per evocare un PS corrispondente al 45% dell'ampiezza massima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Compound test
	<ol>
<li>Effettuare diluizioni dei composti da testare in ACSF gasati affinché la concentrazione finale di DMSO non superiore allo 0,1%.</li>
		<li>Aggiungere alla soluzione di controllo alla stessa concentrazione di quella nella soluzione composta DMSO.</li>
		<li>Registrare un singolo (punto 3.2) o un PS di accoppiare-impulso (punto 3.3) evocato da stimoli collaterali di Schaffer ogni 30 s per almeno 30 min. La forma di PS deve essere stabile durante questo periodo di previsione.</li>
		<li>Preparare un becher con gasati rACSF contenente una concentrazione fissa del composto da testare.</li>
		<li>Irrorare le fettine di ippocampo con questa soluzione mentre ancora registrando il singolo o accoppiare-impulso PS.</li>
		<li>Valutare il recupero dall'effetto composto irrorando la fetta con gasati rACSF senza il composto. Nota: Per effetti reversibili, il PS Torna alla sua forma iniziale osservato durante il periodo della linea di base prima dell'applicazione di composto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi dei dati
	<ol>
<li>Media le tracce di PS registrata durante l'esperimento in blocchi di 4 utilizzando il software di analisi dati.</li>
		<li>Misurare le ampiezze di PS delle tracce media.</li>
		<li>Normalizzare le ampiezze come percentuale dei valori di baseline registrato 10 min prima che irrora un composto.</li>
		<li>Esprimere i dati come media ± SEM</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. 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Gli autori Frédéric Knoflach e Maria-Clemencia Hernandez sono dipendenti di F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basilea, Svizzera, una società farmaceutica. L'autore Daniel Bertrand è un dipendente di 6 HiQScreen Sàrl, rte de Compois, 1222 Vésenaz Ginevra, fornendo servizi di screening per le aziende farmaceutiche.

Lo sviluppo di nuovi composti attivi a un canale ionico legante-gated come i recettori GABAA richiede l'utilizzo di approcci multipli. In genere, il primo passo è spesso condotto mediante analisi obbligatorie; Tuttavia, tali misure sono insufficienti per caratterizzare l'attività fisiologica del composto o sua farmacologia preciso. In particolare, un composto che si lega a un recettore può migliorare o inibire la sua funzione o anche non produrre alcun effetto funzionale (tacere) (cioè, legano al recettore senza modificare la sua funzione). Quindi, un test funzionale è necessario per una caratterizzazione completa composta.
Saggi di binding: Il vantaggio principale del dosaggio associazione è che può essere condotta in modo efficiente su un gran numero di campioni che vanno fino a diverse migliaia e che fornisce affinità di legame per molecole attive. Come descritto nel presente documento, il primo passo consiste nello stabilire un metodo per la valutazione dei sottotipi del ricevitore desiderato. Vale a dire, mentre l'associazione può essere condotta su recettori nativi da frazioni o intero cervello, tale metodo impedirà la determinazione delle affinità a sottotipi recettoriali specifici. Pertanto, è necessario utilizzare sistemi ricombinanti per molecole schermo presso la destinazione desiderata. Al giorno d'oggi, una trasfezione transiente o stabile dei cDNA subunità del recettore desiderata in linee cellulari offre un metodo efficiente e affidabile per esprimere i sottotipi del ricevitore di interesse (ad es., GABAA α5β3γ2). Associazione tradizionale saggi fanno uso di radioligands, ma al giorno d'oggi le tecniche sono disponibili che evitare l'inconveniente di movimentazione radioattività (ad es., basati sulla fluorescenza quantitativa ligand-legantesi).
Espressione funzionale in un sistema host: Per esprimere geni in un sistema host, la sequenza di codificazione di interesse deve essere inserita in un plasmide contenente i promotori adeguati. In genere, per la sintesi di mRNA in vitro , i promotori di T7 o T6 batterici vengono utilizzati. Per un'espressione di cDNA, la trascrizione del gene di interesse deve essere regolata da un promotore dell'eucariota come CMV (citomegalovirus) o equivalente. Al giorno d'oggi, diversi plasmidi, compresi i due promotori (cioè, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), sono disponibili permettendo una sintesi in vitro di mRNA o un'espressione di cDNA come mostrato in Figura 15. Un'espressione dei recettori GABAA possa essere ottenuta fedelmente nelle linee cellulari o in ovociti di Xenopus . I principali vantaggi di questi ultimi sono la mancanza di espressione del recettore endogeno, la semplicità di manipolazioni e la disponibilità di un sistema automatizzato per micro-iniezioni e registrazioni. Le procedure descritte in questo protocollo illustrano l'efficienza del sistema automatizzato che consente l'iniezione di 96 ovociti in circa 7 minuti e non richiede nessuna abilità di micromanipolazione. Ricordando che un unico ovario da una Xenopus contiene tra 10.000-30.000 ovociti, è chiaro che un gran numero di misurazioni delle cellule può essere condotta su una singola preparazione. Inoltre, come un'espressione può essere condotta mediante iniezioni di cDNA, lo stessi plasmidi contenenti i geni di interesse che sono stati sviluppati per gli esperimenti di associazione possono essere utilizzati per una caratterizzazione funzionale senza la necessità di ulteriore biologia molecolare manipolazioni.
Data la sua grande dimensione e alta espressione di superficie, un singolo ovocita produce un numero di recettori che è approssimativamente equivalente a cellule confluenti in una capsula di Petri da 35 mm. Tuttavia, un'iniezione e preparazione di ovociti rappresenta una frazione del costo di una linea cellulare, come gli esperimenti non richiedono un terreno di coltura specifico e manipolazioni sterili. L'attivazione di un singolo canale di GABAA produce pochi picoamperes (10-12) e le correnti che vanno fino a decine di microampere (10-6) sono facilmente registrate in un singolo oocita, che conferma l'attività concomitante di diversi milioni di recettori durante una singola risposta.
Un primo passo nella caratterizzazione dei canali ionici ligando è spesso la determinazione dell'apparente affinità dei recettori. Gli esperimenti che devono essere condotte sono costituiti da applicando una serie di impulsi di prova breve agonista e tramando l'ampiezza dell'evocati corrente o, in alcuni casi, l'area sotto la curva (AUC) in funzione del logaritmo della concentrazione dell'agonista. Come è facilmente fattibile da microinject plasmide diverse concentrazioni e rapporto nello stesso batch di ovociti, questo sistema di espressione è particolarmente appropriato per tale caratterizzazione. Inoltre, un confronto lotto ha rivelato un alto grado di stabilità per diversi CE50s. L'influenza della composizione in subunità su affinità apparente del ricevitore è visualizzato prontamente usando una trama di ragno, come esemplificato nella Figura 10.
I risultati del morsetto tensione due elettrodi ottenuti in ovociti di Xenopus sono spesso confrontati con le registrazioni effettuate usando elettrodi di patch clamp. Considerando che andrebbe oltre lo scopo di questo lavoro per andare in un confronto dettagliato tra questi due sistemi, possono essere esaminati alcuni punti. Mentre un morsetto di patch in cellule offre vantaggi per una caratterizzazione biofisica con un'applicazione veloce di droga, i requisiti sono più complessi di quelli delle registrazioni del due-elettrodo in ovociti di Xenopus . Una difficoltà prima e non trascurabile è l'espressione di una data proteina con la necessità di una coltura cellulare, un transitorio o trasfezione stabile e l'identificazione delle cellule che esprimono il costrutto desiderato. Inoltre, è indispensabile esaminare il possibile contributo dell'espressione endogena nella cella considerata. Inoltre, una registrazione di morsetto di patch richiede una persona esperta per condurre la micromanipolazione sotto un microscopio ad alto ingrandimento, mentre quella persona deve anche eseguire un'analisi adeguata durante l'esperimento per valutare, ad esempio, la qualità della guarnizione, la resistenza di accesso ecc In contrasto, un morsetto di tensione del due-elettrodo registrazione, specialmente uno utilizzando un sistema elettrofisiologico automatico, non richiede competenze specifiche e può essere condotta dai tecnici di laboratorio.
Quando l'acquisizione di un set-up elettrofisiologico, costo considerazione è certamente un fattore importante che deve essere attentamente analizzati. Ad esempio, mentre il costo di un sistema automatizzato è relativamente alto, un confronto più vicino rivela che l'installazione di un rig elettrofisiologico completo include l'acquisto di attrezzature quali buone micromanipolatori, una lente binoculare, un amplificatore, una perfusione sistema e un tavolo antivibrazione, mentre anche l'acquisizione di dati e l'esecuzione di un'analisi. Un confronto dei costi tra un due-elettrodo tensione morsetto set-up contro un set-up di patch clamp rivela ulteriormente discrepanze. Inoltre, il sistema automatizzato offre il vantaggio di attrezzature completamente automatizzate e viene eseguito in automatico giorno e notte.
Le proprietà farmacologiche di un composto sono determinate dalla relativa modalità di azione sui recettori. Ad esempio, inibitori competitivi sono molecole che possono immettere la stessa associazione tasca, o ortosterici sito, come l'agonista stessa provoca un concorso. Inibitori non-competitivi sono composti che inibiscono i recettori interagendo in un altro sito e, nel caso di un canale ionico legante-gated, che possono inserire e bloccare il poro ionico, ad esempio. Andrebbe oltre lo scopo di questo lavoro per esaminare i diversi meccanismi di interazione, ma ulteriori informazioni possono essere ottenute da un libro di testo farmacologico e/o da altri lavori come Bertrand e di Bertrand22.
Nel caso di modulatori allosterici, il composto si lega a un sito che è distinto dal sito ortosterici, ma la presenza della molecola modifica la barriera energetica tra gli Stati attivi e altri. Modulatori allosterici positivi (PAMs) sono composti che riducono la barriera energetica da riposo allo stato attivo e, di conseguenza, migliorano l'effetto dell'agonista. Per caratterizzare gli effetti possibili di PAM, è, pertanto, necessario per determinare se un'esposizione al composto migliora la risposta per l'agonista e, in caso affermativo, a quale concentrazione. Gli esperimenti presentati in Figura 11 e Figura 14 illustrano protocolli che possono essere utilizzati con successo per la caratterizzazione di PAMs presso i recettori GABAA .
In alcuni casi, l'esposizione a PAM da solo potrebbe essere sufficiente per attivare i recettori. Tale attività può essere determinata da una leggera modifica del protocollo sperimentale presentato qui. Vale a dire, invece di utilizzare una co-applicazione del modulatore durante l'esposizione al GABA, il protocollo può essere modificato per l'applicazione di primo il composto da solo e quindi in presenza di GABA. Una caratterizzazione dell'attività agonista diretto avverrà tramite la determinazione dell'ampiezza della risposta evocata dal composto stesso e rispetto all'attuale GABA-evocati.
Esperimenti condotti nelle fette del cervello, come illustrato nella Figura 7, vengono utilizzati per confermare l'attività del composto a recettori nativi in un circuito inibitorio definitivo prima di andare avanti nei modelli animali e lungo il sentiero verso sperimentazioni cliniche. Il protocollo di registrazione e analisi di dati relativamente semplice permette la classifica dei più composti valutando il loro effetto modulatory differenziale sull'ampiezza di PS. Non specifici effetti di composti che non sono legati al sistema GABA possono anche essere rilevato (per esempio, quando sono osservati cambiamenti nella forma PS). Diretto, neurotrasmissione GABAergica può essere valutata in questi casi di misurare gli effetti dei composti su correnti postsinaptiche inibitorie (IPSCs) utilizzando le cellule intere patch clamp tecnica8.

Qui, presentiamo i protocolli per la scoperta di composti attivi sui recettori GABAA , dall'associazione alla fisiologia e alla farmacologia. Nella ricerca di nuove molecole specifiche per i recettori GABAA , è cruciale per definire, nel modo più preciso possibile, il sottotipo di interesse e la valutazione della specificità dei composti recentemente identificati (ad es., per una rassegna, Vedi Rudolph e Knoflach1o Sieghart2). Il percorso tipico in drug discovery e i passaggi che devono essere raggiunti sono illustrati nella Figura 1.
Analisi obbligatorie sono state e sono ancora in gran parte utilizzate come il primo passo nella scoperta della droga. Nel caso di recettori GABAA , sono ottimizzati per identificare i composti che si legano al sito di legame delle benzodiazepine, del recettore, dove associare farmaci terapeuticamente utili e sicuri. Altre tecniche, utilizzando fluorometrica imaging piastra lettore (FLIPR) membrana potenziale saggi basati su colorante rosso3, rilevano composti come i barbiturici che legano ad altri siti che sono meno desiderabili a causa del loro profilo di effetti collaterali indesiderato. Inoltre, i coloranti utilizzati direttamente possono attivare recettori GABAA , così in discussione l'utilità di questi saggi per drug discovery4. Analisi di associazione può fornire solo la prova che un determinato composto può essere associato a una classe di recettori specifici. In vitro saggi con le membrane cellulari sono utilizzati per identificare selettivo umani ligandi dei recettori GABAA α5β3γ2. Transitoriamente transfected le cellule HEK293 esprimendo l'umano GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 e α3β3γ2 recettori vengono utilizzate per preparare le membrane per queste analisi. L'effetto dei ligandi è rilevata misurando la scintillazione di flumazenil [3H] associati a recettori di membrana (un'inibizione del legame di flumazenil [3H]). Il vantaggio principale di questa tecnica è che una determinazione rapida ed efficiente dell'affinità al recettore di interesse composto-associazione viene fornita presso il recettore di interesse.
Gli studi funzionali sono essenziali per valutare l'attività funzionale dei composti e di proporre una spiegazione fisiologica e farmacologica dei meccanismi causato dall'associazione dei composti ai recettori. Oggi, è incontestato che funzionale dei recettori GABAA risultato dall'assemblaggio di cinque subunità attorno a un asse di pseudosymmetry formata dal poro ionico e risultato dall'assembly di cinque subunità identiche. La maggior parte dei recettori GABAA sono composti da due o più unità secondarie differenti. Il recettore importante del cervello GABAA , per esempio, è composta delle subunità α1, β2 e γ2 in una stechiometria di 2, 2 e 1 rispettivamente5,6. Una ricostituzione in un sistema host come gli ovociti di Xenopus o cellule HEK293 offre la possibilità di esplorare rapidamente le proprietà farmacologiche dei recettori.
Le proprietà farmacologiche dei composti sono poi Esplorate con registrazioni extracellulari nel cervello fette7. Questo metodo permette un'esplorazione dell'effetto dei composti sulla neurotrasmissione e fornisce un modo efficace per confermare gli effetti funzionali dei composti determinati in sistemi eterologhi a livello dei recettori nativi in generale ambiente di un neurone. Neurotrasmissione GABAergica è valutabile anche a livello molecolare, misurando gli effetti dei composti su correnti postsinaptiche inibitorie (IPSCs)8. Ma il protocollo usato qui e basate sulle cellule intere patch morsetto registrazioni nelle fette del cervello è più elaborato e produce una velocità di trasmissione inferiore.
Infine, la forza e debolezza in vitro screening cascata utilizzato per l'identificazione di ligandi selettivi per α5β3γ2 è discussi nella prospettiva di diverse tecniche e i loro limiti intrinseci. Questo lavoro dovrebbe fornire esperti e non esperti nel campo dei recettori GABAA una recensione utile la combinazione di approcci diversi in vitro utilizzata per affrontare la scoperta di nuovi modulatori di questi canali ionici ligando.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1024px;" width="1023">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">General equipment</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96 well cell harvester -(Filtermate 196)&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>To filter membranes with bound radioligand</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Microplate Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Vial Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Liquid&#160; handler (Biomek 2000)</td>
			<td style="width:169px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To prepare compound dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">Vortex (Vortex Genie 2)</td>
			<td>Scientific industries Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To mix compound stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td>
			<td>Kinematica AG</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To resuspend the membrane preparations</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">XLfit5 software</td>
			<td style="width:169px;">Microsoft Excel 
			&#160;add-on by IDBS</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Curve fitting software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Smart Pull</td>
			<td>UniPix</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Electrode Puller</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RoboInject</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">HiClamp</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMining</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMerger</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Processing Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Digidata 1550</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Low noise data acquisition system</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">CyberAmp 380 or equivalent</td>
			<td style="width:169px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Programmable Signal Conditioner</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">pClamp program suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Software for data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Antivibraton table&#160;</td>
			<td style="width:169px;">TMC</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To avoid microelectrode vibrations&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Patchstar Micromanipulators</td>
			<td style="width:169px;">Scientifica</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To accurately position microelectrodes in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Faraday Cage&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To isolate recordings from noise</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td style="width:169px;">Campden Instruments LTD&#160;</td>
			<td></td>
			<td>To prepare brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Borosilicate glass micropipette&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Warner Instruments</td>
			<td>GC150TF-10</td>
			<td style="width:253px;">To record extracellular potentials in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td>
			<td style="width:169px;">World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">To stimulate the brain slices with current</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>STG4000</td>
			<td style="width:253px;">Delivers the current to the stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Plasticware</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate round bottom</td>
			<td style="width:169px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">#3365</td>
			<td>Used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2&#181;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard&#160;</td>
			<td>#6005174</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">50 mL Tubes</td>
			<td style="width:169px;">Falcon&#160;</td>
			<td>#352070</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120086</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 2 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120094</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Shipping tubes 180ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Semadeni Europe AG&#160;</td>
			<td>#3722</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Pony vial Polyethylene 6ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#6013329</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Top Seal&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#60051859</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>BELLCO # 1965-00100</td>
			<td>Spinner Flask</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Conical)</td>
			<td style="width:169px;">Thermo Scientific Milian</td>
			<td>56368</td>
			<td style="width:253px;">Injection plate for the oocytes</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Flat bottom)</td>
			<td style="width:169px;">Corning (Vitaris Switzerland)</td>
			<td>3364-cor</td>
			<td style="width:253px;">Compound Plate for the HiClamp</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Hilgenberg (Germany)</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:253px;">borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RNA preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ambion mMessage mMachine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>for the in vitro synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stock solution of test compounds 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Diazepam 4mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microscint 40&#160;</td>
			<td>Packard&#160;</td>
			<td>#6013641</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ultima Gold&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td style="width:136px;">#6013329</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">MS-222</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5040</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">AB/AM</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5955</td>
			<td>antibiotics / antimycotics</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Collagenase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # C1030</td>
			<td>Collagenase Type I</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Rnase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # R2020-250 mL</td>
			<td>RNaseZAP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">EndoFree Plasmid maxi Kit</td>
			<td style="width:169px;">Qiagen</td>
			<td>Qiagen # 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Membranes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;">Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: &#945;1&#946;3&#947;2, &#945;2&#946;3&#947;2, &#945;3&#946;3&#947;2, &#945;5&#946;3&#947;2. See Ballard et al 2009 for detailed methods.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

Questa presenta manoscritto un protocollo dettagliato per lo screening composti a gamma-amminobutirrico acido digitare un recettori (GABAA) ed il relativo uso verso l'identificazione di nuove molecole attive nei saggi preclinici da un ricombinante in vitro recettore ai loro effetti farmacologici dei recettori nativi nelle fette del cervello del roditore. Per composti vincolante al sito del recettore delle benzodiazepine, il primo passo è quello di impostare una schermata principale che consiste di sviluppare analisi obbligatorie radioligand sulle membrane delle cellule che esprimono i principali sottotipi di GABAA . Poi, approfittando dell'espressione eterologa dei recettori GABAA roditore e umani in oociti di Xenopus o cellule HEK 293, è possibile esplorare, nelle analisi elettrofisiologiche, le proprietà fisiologiche del recettore diverso le proprietà farmacologiche dei composti identificati e sottotipi. Il sistema di ovociti di Xenopus sarà presentato qui, a partire con l'isolamento di ovociti e loro microiniezione con differenti mRNA, fino alla caratterizzazione farmacologica utilizzando due elettrodi tensione morsetti. Infine, le registrazioni condotte nelle fette del cervello del roditore saranno descritto utilizzati come secondario fisiologico test per valutare l'attività delle molecole alle loro recettori nativi in un circuito ben definito di un neurone. Registrazioni extracellulari utilizzando le risposte di popolazione dei neuroni multipli sono dimostrate unitamente alla domanda di droga.

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Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Qui, presentiamo protocolli per scoprire composti attivi sui recettori GABAA , dall'associazione alla fisiologia e alla farmacologia.

Metodi per la scoperta di nuovi composti modulando un recettore dell'acido Gamma - aminobutirrico tipo una neurotrasmissione

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

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13.4K Views.  Roche Innovation Center Basel. Qui, presentiamo protocolli per scoprire composti attivi sui recettori GABAA , dall'associazione alla fisiologia e alla farmacologia.

Video: Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction. Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in animal research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. For this study, we used a novel approach to studying drug reinforcement in rats by combining traditional CPP and self-administration methodologies. We assembled an apparatus using two Med Associate operant chambers, sensory stimuli, and a Plexiglas-constructed neutral zone. These modifications allowed our experiments to encompass motivational aspects of drug intake through self-administration and drug-free assessment of drug/cue conditioning strength with the CPP test. In our experiments, rats self-administered cocaine (0.75 mg/kg/inj, i.v.) during either four (e.g., the "short-term") or eight (e.g., the "long-term") alternating-day sessions in an operant environment containing distinctive sensory cues (e.g., olfactory and visual). On the alternate days, in the other (differently-cued) operant environment, saline was available for self-infusion (0.1 ml, i.v.). Twenty-four hours after the last self-administration/cue-pairing session, a CPP test was conducted. Consistent with typical CPP findings, there was a significant preference for the chamber associated with cocaine self-administration. In addition, in animals undergoing the long-term experiment, a significant positive correlation between CPP magnitude and the number of cocaine-reinforced lever responses. In conclusion, this apparatus and approach is time and cost effective, can be used to examine a wide array of topics pertaining to drug abuse, and provides more flexibility in experimental design than CPP or self-administration methods alone.

Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. In this report, we combined traditional CPP and self-administration methods as a novel approach to studying drug reinforcement and addiction in rats.

Nuovo Apparato e metodo per il rinforzo della droga

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Ricerca

Neuroscienze

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

L&#39;applicazione di una conduttanza recettore NMDA nei neuroni dopaminergici mesencefalo Rat Utilizzando la tecnica dinamica morsetto

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Nanoinjection associato e test Elettrofisiologia allo schermo per la bioattività dei composti con il Drosophila melanogaster Sistema Fiber Giant

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Metodi per l&#39;auto-somministrazione per via endovenosa in un modello murino

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Ad alta risoluzione magnetica funzionale per immagini Metodi risonanza per mesencefalo umano

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Metodi per studiare i meccanismi d&#39;azione di farmaci antipsicotici in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to degeneration and injury of small-diameter sensory neurons, referred to as small fiber neuropathy. Present animal models of small fiber neuropathy affect both large- and small-diameter sensory fibers and thus create a neuropathology too complex to properly assess the effects of injured small-diameter sensory fibers. Therefore, it is necessary to develop an experimental model of pure small fiber neuropathy to adequately examine these issues. This protocol describes an experimental model of small fiber neuropathy specifically affecting small-diameter sensory nerves with resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), through a single dose of intraperitoneal injection, referred to as RTX neuropathy. This RTX neuropathy showed pathological manifestations and behavioral abnormalities that mimic the clinical characteristics of patients with small fiber neuropathy, including intraepidermal nerve fiber (IENF) degeneration, specifically injury in small-diameter neurons, and induction of thermal hypoalgesia and mechanical allodynia. This protocol tested three doses of RTX (200, 50, and 10 &#181;g/kg, respectively) and concluded that a critical dose of RTX (50 &#181;g/kg) is required for the development of typical small fiber neuropathy manifestations, and prepared a modified immunostaining procedure to investigate IENF degeneration and neuronal soma injury. The modified procedure is fast, systematic, and economic. Behavioral evaluation of neuropathic pain is critical to reveal the function of small-diameter sensory nerves. The evaluation of mechanical thresholds in experimental rodents is particularly challenging and this protocol describes a customized metal mesh that is suitable for this type of assessment in rodents. In summary, RTX neuropathy is a new and easily established experimental model to evaluate the molecular significance and intervention underlying neuropathic pain for the development of therapeutic agents.

This study establishes an experimental model of pure small fiber neuropathy with resiniferatoxin (RTX). A unique dose of RTX (50 &#181;g/kg) is optimal for developing a small fiber neuropathy model that mimics patient characteristics and could help investigate the nociceptive molecular significance underlying neuropathic pain.

Che istituisce un modello murino di una neuropatia pura piccola fibra con l'agonista Ultrapotent di Transient Receptor potenziali vanilloidi tipo 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Romanzo passivo metodi di compensazione per la produzione rapida di trasparenza ottica nell'intero tessuto dello SNC

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...