Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Mari e il laboratorio Godenschwege, in particolare Aline Yonezawa, per i commenti e aiutare con questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Istituto Nazionale per la Neurological Disorder and Stroke concessione R21NS06637 di FM e TAG, AB è stato finanziato dalla National Science il premio Foundation numero 082925, URM: Biologia Integrativa per i futuri ricercatori.

1. Elettrofisiologia Rig Set-up <ol><li> L&#39;attrezzatura necessaria per l&#39;impianto elettrofisiologia set-up è descritto in dettaglio da Augustin et al. in questo Journal 14. Si prega di fare riferimento a questo articolo per una spiegazione dettagliata degli apparati elettrofisiologici necessari. </li><li> Modificare il precedentemente descritto elettrofisiologia rig set-up 14 con l&#39;aggiunta di un micromanipolatore sesto, che detiene il nanoinjector. Per accedere facilmente alla testa dell&#39;animale deve essere collocato tra i due elettrodi micromanipolatori stimolanti come mostrato nella Figura 2. </li><li> Prima di iniziare l&#39;esperimento, assicurarsi di avere una gamma comoda su tutti gli assi di rotazione con tutti i micromanipolatori, e che tutti gli elettrodi e la micropipetta iniezione (vedi punto 2) può raggiungere l&#39;animale. </li></ol> 2. Nanoinjection Set-up <ol><li> Il nanoinjection set-up richiede un Nanoliter2000 (World Precisisugli strumenti, Sarasota, FL, USA) o altri tipi di iniettore che permette iniezioni controllate in quantità nanolitri. </li><li> Preparare ago per iniezione utilizzando le micropipette di vetro forniti con l&#39;iniettore tirando ad una resistenza di 80-100 mQ con un estrattore elettrodo. </li><li> Per iniezioni lisce è necessario smussare le micropipette ad un&#39;apertura 11-17 micron ad un angolo di 45 gradi (Figura 3). </li><li> Lentamente la micropipetta in sostegno degli iniezione con olio sintetico, utilizzando una siringa Hamilton come da istruzioni del manuale Nanoliter2000, assicurandosi che non siano presenti bolle d&#39;aria. </li><li> Cautela fissare il micropipetta sul nanoinjector e si prepara a caricare il composto con lo svuotamento olio in eccesso secondo le istruzioni del manuale Nanoliter2000. </li><li> Posizionare l&#39;iniettore sul micromanipolatore e caricare il composto come indicato nel manuale Nanoliter2000. Assicurarsi che la punta della micropipetta non si rompe durante questoprocedura. </li><li> Impostare la quantità desiderata di nanolitri da iniettare nella casella di controllo dell&#39;iniettore secondo le istruzioni del manuale Nanoliter2000. Si prega di notare che l&#39;iniezione di importo complessivo non deve superare i 100 nl. Abbiamo trovato che grandi quantità di soluzioni saline controllo può influenzare la funzione del circuito GFS. </li><li> È fondamentale disporre l&#39;iniettore scollegato dalla scatola di controllo durante l&#39;acquisizione di registrazione con l&#39;eccezione della stessa iniezione, poiché l&#39;alimentazione del nanoinjector interferisce con le registrazioni, che è visibile come rumore di fondo (Figura 4). Tuttavia, non togliere l &#39;alimentazione alla scatola di controllo come sarà ri-impostato. </li></ol> 3. Drosophila melanogaster Preparazione <ol><li> Anestetizzare da 2 a 6 mosche giorno di vita con la CO 2 o su ghiaccio come descritto in precedenza 14,15. </li><li> Una volta immobile, usare un paio di pinzette per trasferire l&#39;animale a una rete Wi piccolo piattoth cera molle dentale raccoglierlo dalle sue gambe. Si prega di notare che un moscerino della frutta maschio pesa circa 1,0 mg e un moscerino della frutta femmina pesa circa 1,2 mg, così composto a corpo rapporto peso è diverso nei moscerini maschi contro femmine. Pertanto, si raccomanda di utilizzare solo un genere per gli esperimenti. </li><li> Come descritto in precedenza 14,15, con attenzione montare la mosca lato dorsale fino e assicurare che il torace e la testa vengono immobilizzati con morbida cera dentale disposte intorno al corpo. Attentamente diffondere le ali in modo che depongono perpendicolare al torace (Figura 2, C). La mosca deve essere montato con il minor danno possibile. </li></ol> 4. Nanoinjection associati / elettrofisiologia <ol><li> Posizionare il fly montato sul rig elettrofisiologia con la testa verso gli elettrodi stimolanti. </li><li> Infilzare l&#39;animale con il corrispondente stimolante, a terra e gli elettrodi di registrazione come descritto in precedenza 14,15 (FIGURA 2, C). Salvo diversa desiderato, posto un elettrodo di registrazione nel DLM e l&#39;altra nel muscolo TTM. Il muscolo DLM è situato nel torace tra le anteriori dorso-centrali capelli e la linea mediana della mosca. Il muscolo TTM si trova vicino gli allegati ala, tra le anteriori e posteriori Supra-alari peli della mosca 7. </li><li> Allineare la micropipetta iniezione contenente il composto con il centro delle tre ocelli situata sulla porzione mediale posteriore della testa, ma non ancora iniettare (figura 2, C). </li><li> Prima di compound per iniezione di ottenere una registrazione di base del GF di TTM e GF a DLM percorsi del sistema Fiber Giant (GFS, Figura 1) attraverso la stimolazione del cervello. Per farlo, attivare le fibre giganti (GFS) con 10 treni di 10 stimoli (40-50 mV), ciascuno determinato per una durata di 0,03 ms a 100 Hz con un ritardo di 1 secondo tra i treni 14,15 (Figura 4). Tipo selvatico vola should essere in grado di seguire one-to-one a questo ritmo di stimolazione sia per DLM e le vie di TTM. Eliminare la mosca se il GF di DLM e GF a percorsi TTM non seguono la stimolazione 100 Hz con un rapporto 1:1. </li><li> Passa alla stimolazione continua del GF con singoli impulsi a 1 Hz (Figura 4). </li><li> Collegare rapidamente l&#39;iniettore nella casella di controllo. Anche se il rumore di fondo interferisce con le registrazioni 1 Hz stimolazione, non interrompere. </li><li> Inserire delicatamente la micropipetta iniezione nella capsula testa della mosca appena sotto il cuticule, e iniettare la quantità desiderata di composto nella emolinfa della mosca mantenendo la stimolazione 1 Hz (Figura 4). Grazie al sistema circolatorio aperto della mosca, l&#39;intero sistema nervoso verrà esposta al composto in pochi secondi. Anche se un particolare sito di iniezione non è critico per fornire composti nella emolinfa, troviamo la regione del ocelli, che vengono localizzared mediale sul lato più dorsale della capsula testa, per essere un sito conveniente che consente una facile iniezione che porta ad una distribuzione rapida ed uniforme del composto. </li><li> Rimuovere immediatamente micropipetta iniezione dal sito di iniezione e scollegare l&#39;iniettore dalla casella di controllo, pur continuando la stimolazione GF 1 Hz fino a 1 min dopo l&#39;iniezione (figura 4). </li><li> Al fine di rivelare effetti più sottili di composti sulla GFS, sottolineano le fibre giganti (GFS) con 10 treni di 10 stimoli a 100 Hz con un ritardo di 1 secondo tra i treni. Continua per testare la funzione dei percorsi GF con questo paradigma ogni 5 minuti fino a 15 minuti (Figura 4). Tuttavia, intervalli più brevi o più lunghi periodi di monitoraggio sono inoltre possibili. </li><li> Al fine di verificare se il composto ha un effetto a giunzioni neuromuscolari (NMJs) del GFS, ed eventualmente ridurre gli effetti del composto, procedere per attivare il motore neuroni direzioneTLY dalla stimolazione toracica. Per questo, rimuovere gli elettrodi stimolatori dagli occhi e sostituirli sui lati anteriori del torace per stimolare i neuroni motori con 10 treni di 10 stimoli a 100 Hz. </li></ol> Nota: Le tracce elettrofisiologia mostrati nel video non corrispondono agli effetti di iniezione colorante puro. 5. Risultati rappresentativi Effetto di un antagonista del PSI di DLM sinapsi del sistema Fiber Giant Methyllycaconitine citrato (MLA) è un antagonista nAChR che è specifico per α7 sottotipi nAChR. Il PSI di DLMn sinapsi in GF-DLM percorso dipende dal sottotipo Dα7 nAChR per il corretto funzionamento, mentre la rimozione genetica di Dα7 sottotipo nAChR ha alcun effetto sulla GF-TTM percorso 5,6. Per dimostrare la specificità e la sensibilità del nostro dosaggio MLA abbiamo iniettato a differenti concentrazioni (0, 0,02, 0,04, 0.08, 0,12 ng / mg, 46 nl iniettato) nella testa dell&#39;animale (n = 10 per il trattamento composto; n = 15 per il trattamento salino). Solo le mosche maschio (di tipo selvatico genotipo selvatico 10E) sono stati utilizzati, e l&#39;effetto del composto è stata monitorata per un totale di 15 minuti dopo l&#39;iniezione. Figura 5 illustra la differenza tra registrazioni di base ottenute prima dell&#39;iniezione e quelli ottenuti dopo l&#39;iniezione in risposta a MLA e soluzione salina di controllo. Abbiamo trovato che l&#39;iniezione di MLA ha portato alla incapacità del GF-DLM percorso da seguire one-to-one a 100 Hz da stimoli del GF nel cervello, mentre il GF-TTM percorso rimasto inalterato. (Figura 5, traccia top e middle, t-test eseguito tra i controlli saline [0 ng / mg] e le diverse concentrazioni di MLA ad ogni tempo a meno che i dati non è parametrico [normalità e varianze uguali testato], altrimenti usiamo uno Mann-Whitney test somma dei ranghi. * p &lt;0,001). Tuttavia, uno-a-uno response del DLM è stata osservata quando i motoneuroni sono stati stimolati direttamente (Figura 5, traccia inferiore), dimostrando che la funzione NMJ del DLM e TTM non è influenzata da MLA. MLA è apparso per raggiungere il suo massimo effetto 1 minuto dopo l&#39;iniezione per 0,04, 0,08 e 0,12 ng / mg di MLA iniettato, poiché non sono cambiamenti significativi sono stati notati durante i successivi 15 minuti di periodo di prova. Inoltre, il composto ha raggiunto un effetto massimo a 0,08 ng / mg poiché forti risposte non sono state osservate con la dose maggiore di 0,12 ng / mg. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Il Gigante Diagramma di fibra del Sistema Fiber Giant (GFS). Le fibre giganti (GFS, mostrato in rosso) sinapsi elettricamente (Gap Junction) e chimicamente (colinergica) su un Interneuron sinapsi periferica (PSI, mostrati in verde) e il Trochanteral Tergo neurone muscolare (TTMn, mostrato in giallo) 5. Il PSI DLMn (dorsale neurone muscolare longitudinale, in blu) la connessione dipende Dα7 sottotipo nAChR 6. Infine, la giunzione neuromuscolare (NMJ) del TTMn e DLMn sul salto (TTM, mostrato in viola) e dei muscoli di volo (DLM, mostrato in viola) è glutamatergica. Nota: il GF e la connessione di PSI è sia elettrica e chimica. Tuttavia, in mutanti shakB (che mancano giunzioni), nessuna risposta può essere registrato dal DLM dopo stimolazione del FG nel cervello, dimostrando che il componente chimico in assenza di collegamenti elettrici non è sufficiente a evocare un potenziale di azione nella PSI 5,16-18. Perché il GF alla connessione PSI è giunto dipende gap, questa figura mostra solo il bivio GAP alla sinapsi per ragioni di semplicità. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Micromanipolatori set-up. <ol class="ualpha"><li> Una versione modificata del set-up di uno precedentemente pubblicato con il protocollo 14 è utilizzato per adattare il micromanipolatore iniezione per coppie di registrazioni GFS con nanoinjections simultanei. La preparazione fly montato è orientato con la testa della mosca verso lo sperimentatore. Il micromanipolatore iniezione (# 1) è posto di fronte al sperimentatore tra i due manipolatori per gli elettrodi di tungsteno stimolante (# 2 e # 3). I due elettrodi di registrazione micromanipolatori per il vetro (# 4 e # 5) sono disposti sul lato sinistro e destro, rispettivamente. Il micromanipolatore per l&#39;elettrodo di massa di tungsteno (# 6) è posto più lontano nella parte posteriore o sul lato sinistro (qui illustrato) o sul lato destro. </li><li> Una stretta vista dall&#39;alto del regime dei vari elettrodi e micropipette iniezione. </li><li> Un montato correttamente D. melanogaster impalato con elettrodi e micropipette iniezione pronta per l&#39;iniezione. Si noti che il corpo dell&#39;animaleè montato con il torace in orizzontale e le sue ali sparsi. La cera viene saldamente avvolto attorno al corpo impedendo l&#39;animale da movimento. Inoltre, l&#39;elettrodo di massa (# 6, nell&#39;addome), gli elettrodi di registrazione di vetro (# 4 e # 5, nel torace, evidenziato da contorni scuri), e gli elettrodi stimolatori (# 2 e # 3, uno in ciascun occhio ) sono impalati in posizione, come descritto in precedenza 14. La micropipetta di iniezione (# 1) sia correttamente allineato con il centro dei tre ocelli (cerchiato). Inserimento della micropipetta iniezione deve essere posto in questo settore. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Micropipetta iniezione smussato. Un diagramma di una micropipetta correttamente smussati viene mostrato qui. L&#39;apertura elettrodo deve essere smussata con un angolo di 45 gradi e ha un&#39;apertura tra 11 a 17 um. Una micropipetta corretta iniezione smussata è cruciale per una iniezione regolare con un minimo damage al fly. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Schema generale della nanoinjection / elettrofisiologia protocollo. Un diagramma rappresentante del regime generale per la nanoinjection / protocollo elettrofisiologia. Iniziare ottenendo una registrazione di base, stimolando le fibre giganti (GFS) a 100 Hz con 10 treni di 10 stimoli ciascuna (un solo treno mostrato qui). Prima dell&#39;iniezione, iniziare le stimolazioni 1 Hz uno secondo di distanza. Durante il tempo di iniezione (iniettori, mentre è collegato alla centralina di controllo), si potrà osservare il rumore di fondo significativo, tuttavia, non interrompere le registrazioni. Dopo l&#39;iniezione (iniettore e sia scollegato dalla scatola di controllo), continuare la stimolazione 1 Hz per circa 1 minuto in più. Infine, procedere a sottolineare la FG con 10 treni di 10 stimoli a 100 Hz e continuare a testare la funzione delle vie GF con questo paradigma ogni 5 minuti fino a 15 minuti. Nota: le registrazioni were manipolate per creare lo schema generale e non rappresentano un risultato specifico ottenuto. Non in scala, non tutte le tracce vengono visualizzati. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3597/3597fig4large.jpg">Clicca qui per ingrandire l&#39;immagine</a> . <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Gli effetti di mutua assistenza giudiziaria in GFS. <ol class="ualpha"><li> Una rappresentazione grafica degli effetti dell&#39;antagonista α7 citrato nAChR Methyllycaconitine (MLA) sul GF-DLM percorso della mosca della frutta a diverse concentrazioni (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg n = 10 per il trattamento composto.; n = 15 per il trattamento salino). Solo un minuto dopo l&#39;iniezione, un effetto significativo e immediato è stato visto con 0,04 ng / mg di MLA. Un effetto significativo è stato osservato anche con 0.8ng/mg e 0.12ng/mg di MLA a 100Hz stimolazione del GFS. Nessuna differenza significativa è stata osservata tra i controlli saline e 0,02 ng / mg di MLA. Inoltre, non posso cambiaren effetto è stato osservato dopo 1 minuto dopo l&#39;iniezione durante il tempo di prova (15 minuti). A t-test è stato eseguito tra i controlli saline (0 ng / mg) e le concentrazioni diverse di MLA ad ogni tempo. I livelli sono riportati come media + / - SEM, * p &lt;0,001. </li><li> Tracce del campione delle risposte DLM a 100 Hz stimolazione. Traccia in alto mostra le risposte del muscolo prima dell&#39;iniezione MLA GF dopo stimolazione nel cervello. Si noti che il muscolo è in grado di rispondere ad ogni stimolo uno-ad-uno a 100 Hz. Medio traccia mostra le risposte del DLM MLA dopo l&#39;iniezione (0,12 ng / mg). Si noti che il muscolo non è in grado di rispondere ad ogni stimolo uno-a-uno a 100 Hz. (Asterischi). Traccia in basso mostra le risposte del DLM della stessa preparazione (0,12 ng / mg) dopo stimolazione diretta dei motoneuroni del torace. Poiché DLM risponde uno-ad-uno a 100 Hz con stimolazione toracica, il fallimento delle risposte con stimolazioni cerebrali può essere attribuita alla colinergica PSI-DLMn collegamento. </li><li> Una rappresentazione grafica degli effetti con differenti concentrazioni di MLA (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg) sul GF-TTM percorso. Non sono stati osservati effetti significativi tra salina (0 ng / mg) e iniezioni composti in qualsiasi punto nel tempo. A t-test è stato eseguito tra i controlli saline (0 ng / mg) e le concentrazioni diverse di MLA in ogni punto temporale, * p &lt;0,001. </li><li> Tracce del campione delle risposte TTM a 100 Hz stimolazione. Traccia in alto mostra le risposte del muscolo prima di MLA al momento dell&#39;attivazione di iniezione GF con la stimolazione nel cervello. Si noti che il muscolo è in grado di rispondere a tutti gli stimoli a 100 Hz. Medio traccia mostra le risposte del DLM dopo MLA iniezione (0,12 ng / mg). Risposte dal muscolo TTM alla stimolazione del GF nel cervello rimangono uno-a-uno. Traccia in basso mostra le risposte del TTM della stessa preparazione a 100 Hz stimolazione dei neuroni motori nel torace (0,12 ng / mg). </li></ol>

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Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il nanoinjection / elettrofisiologia biotest qui presentata consente un rapido screening di composti nel sistema nervoso del moscerino della frutta. Si tratta di una nuova tecnica in vivo che richiede piccole quantità di un composto per provocare un effetto su una varietà di bersagli molecolari in un circuito ben caratterizzato neuronale. Questo metodo può essere utilizzato per testare la bioattività di diversi composti, da tossine sconosciuti agenti farmacologici disponibili in commercio. <p class="jov...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Registrazione elettrodi di vetro: vetro borosilicato capillari </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 1B100F-4 </td><td> 1,0 millimetri OD, 0,58 millimetri ID </td></tr><tr><td> Stimolatore </td><td> Grass Instruments </td><td> Modello S48 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificatore </td><td> Come Instruments Inc. </td><td> Modello 5A </td><td></td></tr><tr><td> Acquisizione dati Software: Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> Modello 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Software di raccolta dati: PClamp </td><td> Molecular Devices </td><td> Versione 10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereomicroscopio wesima fibra ottica microscopio illuminatore anulare </td><td> AmScope </td><td> SM-4T Modello HL 250-AR </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione possibilità per il montaggio </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Kite &amp; Manual Micromanipolatore Tilting Base </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila melanogaster selvatica 10E genotipo (ceppo selvatico) </td><td> Bloomington magazzino centrale </td><td> Stock # 3892 </td><td></td></tr><tr><td> Vertical pipette puller </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modello 700c </td><td></td></tr><tr><td> Iniezione micropipette di vetro: vetro borosilicato capillari </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> Catalogo # 4878 </td&gt; <td> 1,14 millimetri OD, 0.5mm ID </td></tr><tr><td> Olio siliconico </td><td> Pescatore </td><td> Catalogo # S159-500 </td><td></td></tr><tr><td> Beyeler </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> KT Brown Type Model # BV-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoliter2000 </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> Catalogo # B203XVY </td><td></td></tr><tr><td> Colorante alimentare blu </td><td> McCormick </td><td> N / A </td><td> Ingredienti: acqua, glicole propilenico, FD &amp; C Blue 1, e 0,1% Propylparaben (conservante). </td></tr><tr><td> Methyllycaconitine citrato (MLA) </td><td> Bioscience Tocris </td><td> Catalogo # 1029 </td><td></td></tr><tr><td> Bastoncini di cera plastica </td><td> Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) </td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the drosophila melanogaster giant fiber system

Composti di screening per l&#39;attività in vivo può essere utilizzato come un primo passo per identificare candidati che possono essere sviluppati in 1,2 agenti farmacologici. Abbiamo sviluppato un nanoinjection / elettrofisiologia nuovo metodo di analisi che permette il rilevamento di effetti modulatori di composti bioattivi sulla funzione di un circuito neuronale che media la risposta di fuga in Drosophila melanogaster 3,4. Il saggio in vivo, che utilizza la fibra Drosophila Giant System (GFS, Figura 1) permette lo screening dei vari tipi di composti, come piccole molecole o peptidi, e richiede quantità minime per provocare un effetto. Inoltre, il GFS Drosophila offre una grande varietà di potenziali bersagli molecolari sui neuroni e muscoli. Le fibre giganti (GFS) sinapsi elettricamente (Gap Junction) e chimicamente (colinergica) su una sinapsi Interneuron Peripheral (PSI) e il Trochanteral Tergo Muscle neurone (TTMn) 5 </sup&gt;. Il PSI di DLMn (dorsale neurone muscolare longitudinale) la connessione dipende Dα7 recettori nicotinici dell&#39;acetilcolina (nAChR) 6. Infine, la giunzioni neuromuscolari (NMJ) del TTMn e la DLMn con il salto (TTM) e dei muscoli di volo (DLM) sono glutamatergica 7-12. Qui, si dimostra come iniettare quantità nanolitri di un composto, ottenendo registrazioni elettrofisiologiche intracellulari dal sistema fibra Giant 13 e come controllare gli effetti del composto sulla funzione di questo circuito. Mostriamo la specificità del test con citrato methyllycaconitine (MLA), un antagonista nAChR, che interrompe il PSI di DLMn connessione, ma non il GF a TTMn connessione o la funzione del NMJ al salto o dei muscoli del volo. Prima di iniziare questo video, è fondamentale che si guarda con attenzione e familiarizzare con il video intitolato &quot;JOVE registrazioni elettrofisiologiche dal sentiero fibra gigante di D. Melanogaster &quot;da Augustin et al 7, come il video presentato qui è inteso come un ampliamento di questa tecnica esistente. Qui si utilizza il metodo elettrofisiologico registrazioni e focalizzazione in dettaglio solo l&#39;aggiunta delle nanoinjections accoppiati e la tecnica di monitoraggio.

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Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Un rapido<em&gt; In vivo</em&gt; Test per verificare i composti neuromodulatori che utilizzano il sistema di Giant Fiber (GFS) di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Descritto. Nanoinjections nella testa dell&#39;animale insieme registrazioni elettrofisiologiche di GFS può rivelare la bioattività dei composti sui neuroni e muscoli.

Nanoinjection associato e test Elettrofisiologia allo schermo per la bioattività dei composti con il Drosophila melanogaster Sistema Fiber Giant

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

paired-nanoinjection-electrophysiology-assay-to-screen-for

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Neuroscience

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

13.0K Views.  Florida Atlantic University. Un rapido In vivo Test per verificare i composti neuromodulatori che utilizzano il sistema di Giant Fiber (GFS) di Drosophila melanogaster Descritto. Nanoinjections nella testa dell'animale insieme registrazioni elettrofisiologiche di GFS può rivelare la bioattività dei composti sui neuroni e muscoli.

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Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

Le registrazioni elettrofisiologiche dal Percorso di Fiber Gigante D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Ricerca

Neuroscienze

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Monte Preparazione tutto il Adulti Drosophila Cordone nervoso ventrale per iniezione Giant Dye Fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Assay Semplice per la quantificazione della Social Prevenzione in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Un test comportamentale per Mechanosensation di cloni in marcm-based<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

High Throughput test per esaminare Preferenze deposizione delle uova dei singoli<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analizzando Synaptic Modulazione di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...