Yazarlar Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab ve Marie Claire Pflimlin Roche üzerinden ve Tifany Schaer ve Deborah Paolucci HiQScreen dan onların mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.

Xenopus laevis yer alan ve Cenevre Kanton hayvan kurallarına göre ele.
1. Radioligand bağlama
<ol><li>
Tahlil plaka hazırlanması
	<ol>
<li>1, 5 L 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl ve 15 mM Tris ile tahlil tamponunun hazırlamak; HCl ile pH 7.4 için ayarlayın.</li>
		<li>50.76 µM (Örneğin, 5 µL bileşik 980 µL tahlil arabellekte bir microcentrifuge tüp içine 10 mm), test edilecek bileşikler hazırlayın. Mix onları iyi bir girdap makine 2 – 5 s için yüksek hızda kullanarak.</li>
		<li>Başvuru bileşik flumazenil öncesi bir seyreltme bileşik (10 mM) pipetting 1 µL tarafından tahlil arabellek 1.970 µL için hazır olun. Mix onları iyi bir girdap makine 2 – 5 s için yüksek hızda kullanarak.</li>
		<li>[3H] flumazenil hisse senedi çözüm 4 4 ° C'de tahlil arabelleği ile seyreltik nM 50 mL polipropilen tüp içinde.</li>
		<li>Pipet 50 µL/iyi tahlil arabelleği sütun 1 ve 3 – 11 / 96-şey Mikroplaka Şekil 2' de gösterilen plaka düzeninde gösterildiği gibi içine.</li>
		<li>50.76 µM seyreltilmiş bileşiklerin 73.2 µL pipet (bkz. Adım 1.1.2) plaka 12 sütuna.</li>
		<li>Geometrik bir ilerleme üzerinde 9 adımları kullanarak her bileşim, seyreltik (1E-10 -1E-06 M), bir 23.12 µL transfer hacmi ve dolgu sütun 3 – 11. Seyreltme iyice karıştırın. İpucu her seyreltme sonra değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre zarları sulandırmak
	<ol>
<li>Daha önce bir HEK293 overexpressing insan GABAA reseptör izole hücre zarlarında çözülme (0,025-0,15 mg/mL), oda sıcaklığında (RT) 80 mL elde edilir ve süspansiyon tahlil arabellek 4 ° C'de transfer</li>
		<li>Membran çözüm hala 4 ° C'de 30-40 s 10.000-12.000 rpm'de için bir doku homogenizer ile resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diazepam non-spesifik bağlantısını (NSB) denetimi için sulandırmak
	<ol>
<li>4 mM diazepam hisse senedi çözüm ile 5 ml 40 µM bir konsantrasyon için tahlil arabelleği sulandırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reaksiyonu başlatmak
	<ol>
<li>4 nM [3H] flumazenil 50 µL 96-şey plaka her kuyuya pipet ve bir buzlu su kabında tutun.</li>
		<li>GABAA reseptör alt türü membranlar hazırlık 0,5 mg/mL bir protein konsantrasyonu için 100 µL ekleyin.</li>
		<li>50 µL 40 µM diazepam 2 sütuna pipet.</li>
		<li>Buz üzerinde 1 h plaka kuluçkaya.</li>
		<li>Her şey bir 96-iyi filtre plaka sonraki membran ayırma ve radyoaktivite ölçümü için tahlil arabelleği 50 µL ekleyin ve reaksiyon sonra durdurmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tepki bırak
	<ol>
<li>50 mM Tris-HCl, pH 7.4 ile çamaşır tampon hazırlayın.</li>
		<li>96-şey hücre hasat kullanarak çözüm filtre. 3 tabak yıkama x 300 µL buz gibi çamaşır arabelleği iyi ücret ile.</li>
		<li>Alt kısmında bir plastik film ile plaka mühür ve mercek sıvı için kokteyl 40 µL eklemek her sayma mercek iyi ve % 70 etanol ile silin.</li>
		<li>En az 1 h plaka RT. yavaşça salla RT, en az bir saat için stand izin</li>
		<li>(BGBM) radyoaktivite plaka bir mercek tezgahın üzerine yerleştirerek ölçmek. Bir şey başına 3 min için ölçme izin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Veri Analizi
	<ol>
<li>Non-spesifik bağlama (NSB) ve toplam bağlama (TB) de çoğaltır veya örneklerin triplicates gelince 8 için Ortalama çoğaltır belirlemek. % Özel bağlayıcı (SB) aşağıdaki denklemi göre her örnek ortalamasını hesaplamak: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Burada, Toplam SB NSB demekeksi demek TB =.</li>
		<li>Apsis % SB karşı koordine içinde içinde inhibitör konsantrasyonlarının arsa. Tek site Yarışması analiz denklemi kullanarak verileri sığdırmak: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Burada, y = SB, % A = y, minimum B y, maksimum = C = IC50, X = rakip bileşim, konsantrasyon günlük10 D eğri (Hill katsayısı) eğimi =.</li>
		<li>Yarım maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50), kullanarak bağlama benzeşim (Ki) hesaplamak ilgili membranlar9ve konsantrasyon [3H] [3H] flumazenil ayrışma sabiti (Kd) Flumazenil tahlil göre aşağıdaki verileri kullanarak denklemi: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. reseptör ifade ve kayıtları Xenopus yumurta içinde
<ol><li>Hasat yumurtalık ve oosit hazırlanması
	<ol>
<li>88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4H2O ve 0,41 mM CaCl2.6H2O, pH 7.4 ile steril Barth çözüm hazırlamak , 100 birim/mL ile penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 0,25 µg/mL amfoterisin b desteklenmiş</li>
		<li>1 x OR2 orta boy (hiçbir CaCl2) hazırlamak 88,5 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, pH 7.4 ile.</li>
		<li>Kurban bir Xenopus Laevis soğutmalı (150 mg/L, pH 7.4 ayarlanmış bir konsantrasyon), Tricaine methanesulfonate ve sodyum bikarbonat (300 mg/L) 20 dk için derin anestezi tarafından kadın işten çıkarma tarafından takip.</li>
		<li>Yumurtalıklar temiz makas ve forseps ile hızla hasat ve 40 mL 1 x Barth çözüm ve antibiyotikler/antimycotic ile dolu 2 Petri yemekler (10 cm) koyun.</li>
		<li>2 hafta 4 ° C'de Barth çözümde Disosiye olmayan yumurtalık saklamak</li>
		<li>Ayrılma için temiz bir tıraş bıçağı ile Yumurtalık küçük kesirler (1-2 cm3) kesme ve onları CaCl2 (OR2-noCaCl2) olmadan OR2 orta 50 ml % 0,2 collagenase içeren kuluçkaya (tip ı) 100 mL spinner 17-19 ° c şişesi 4 – 5 h. manyetik Bar doğrula için yavaş bir ajitasyon ile yaklaşık 3-5 cm yukarısında yumurta kırma önlemek için spinner balonun altındaki yer.</li>
		<li>4 – 5 h sonra yumurtalar çoğunu kendi folikül serbest doğrulayın (yani, onlar yüzmek çevresinde tek tek). Onları yıkamak 5 x 1.8 mM CaCl2ile desteklenmiş OR2 200 mL ile.</li>
		<li>Yumurta Petri-yemekleri (10 cm) Barth çözüm ve antibiyotikler/antimycotics dolu ve en az bir gecede 17 ° c cDNA veya mRNA enjeksiyon önce tutmak defolliculated aktarın.</li>
		<li>Ertesi gün, bir dürbün, bir açık ve farklı hayvan karşı bitkisel pole (hayvan pole karşı açık sarı için bitkisel pole için koyu kahverengi) sunan bir sağlıklı yumurta altında seçin. Temiz Pasteur pipetler kullanın ve yumurtalar teker teker steril konik 96-enjeksiyon iyi tabak atın. Not: Özel bir bakıma mRNA enjeksiyonlar için yumurta yerleşimini gereklidir; Oysa cDNA enjeksiyonlar için yumurta ile hayvan yukarı bakacak şekilde Kutbu yönlendirmek için vazgeçilmezdir.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA veya cDNA otomatik enjeksiyon
	<ol>
<li>Önerilen yönergeleri izleyerek bir ticari olarak mevcut kit kullanarak mRNA'ların sentez. Aletleri ve tablo RNase ile temiz ve uygun koruyucu eldiven giymek. Not: İyi bir ifade vermeye belirleyici kalitesidir mRNA ve enjeksiyon işlemi sırasında mRNA yıkımı önlemek için vazgeçilmezdir.</li>
		<li>Piyasada bulunan bir seti kullanarak cDNAs hazırlamak ve istediğiniz miktarı 0,2 µg/µL bir konsantrasyon, bidistilled suda çözülür.</li>
		<li>10-50 nL 0.2 µg/µL veya 10 nL cDNA çözüm 0,02 – 0,2 değişen bir konsantrasyon, konsantrasyon, mRNA çözümün enjekte µg/µL, tercihen 95 yumurta gruplar halinde.</li>
		<li>Membran için gerektiren birden çok alt birimleri (yani, heteromeric α1β2γ2 GABAA reseptörleri), protein karışımı karşılık gelen mRNA'ların veya istenen oranında cDNAs (yani, 1:1:1 veya 1:10:1).</li>
		<li>Oosit 17 ° c Isı şok proteinleri ifade tarafından yumurta önlemek için tutmak; Mikroplaka ısı kontrollü depolama alanında depolar.</li>
		<li>0.1-1000 adlı OR2 bağlama tahlil pozitif test edildi test bileşikleri dağıtılması µM elektrofizyolojik kayıtlar için ve onları bir 96-şey düz dipli Polipropilen tabak içinde atmayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Plazmid ifade için
	<ol>
<li>Kılavuzlarına bakteriyel T7 veya T6 promotors ile mRNA sentezi için piyasada kitleri izleyin ve bir çözüm 20 µL 0,2 µg/RNase free suda µL olun.</li>
		<li>En az 20 µL cDNA ifade 0.2 µg/µL bidistilled suda, genellikle ökaryot ifade vektör içeren bir çözüm hazırlamak.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroenjeksiyon oosit ve görsel kalite olarak
	<ol>
<li>10-50 nL plazmid içeren çözüm enjekte (bkz. Adım 2.3.1 veya 2.3.2) cam mikro-enjeksiyon iğne 100 µm arasında değişen bir uç çapı ile oluşturulmuş bir basınç Fırlatma sistemi ya bir otomatik enjeksiyon sistemi ile donatılmış bir micromanipulator üzerinde. Not: burada açıklanan örnekte, toplu halde 95 cDNA veya mRNA ile kullanıma uygun otomatik bir sistem ile yumurtalar enjekte edilir.</li>
		<li>Enjeksiyon iğne 1 µL % 1 metilen mavisi gibi bir boya ile doldurun ve standart prosedür (cDNA için çekirdek veya mRNA için sitoplazmada) kullanarak yumurta enjekte.</li>
		<li>Yaklaşık 1 dakika kaynar suda için enjekte yumurta atın. Yumurtalar bir dürbün altında bir tıraş bıçağı ile ikiye böldüm. Not: Boya Şekil 3'Eenjeksiyon hassas bir gözlem izin, gösterildiği gibi lokalize kalır.</li>
	</ol></li>
	<li>İki elektrot gerilimi kelepçe kayıtları
	<ol>
<li>Şekil 4' te gösterilen prensibi kullanır otomatik sistem üzerinde yumurta içeren iyi tabak koyun. Not: Şekil 5' te gösterilen yama kelepçe sistemi aksine, hücre gerçek membran potansiyelini gerilim elektrot tarafından okunur.</li>
		<li>Örneğin, Şekil 6 ' da konsantrasyon etkinlik ilişkisi tayini için resimli düzenine sahip simge tabanlı arabirimi kullanılarak otomatik kayıt sistemi programınız.</li>
	</ol></li>
	<li>Eğri uydurma
	<ol>
<li>Resimli konsantrasyon harekete geçirmek eğrisi kullanarak uygun yazılımı kullanarak sonuçları analiz, geçerli genlik agonist konsantrasyon logaritması bir fonksiyonu olarak arsa.</li>
		<li>Daha sonra formu ampirik Hill denklemde ile donatılmış olabilir sigmoidal eğri uyun: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Burada, Yuyarılmış akım, kısmını = EC %50 50 harekete geçirmek için konsantrasyon = x = bileşik toplama nH = Hill katsayısı veya belirgin cooperativity.</li>
		<li>Bir birlik akımları hücreler bir dizi elde edilen verileri çözümlemek için en yüksek konsantrasyonu, değeri kaydedilen her yanıt karşı genliği bölerek normalize.</li>
		<li>Ortalama ve standart hataları belirlemek ve size mevcut yazılım kullanarak eğri uydurma farkındayız.</li>
	</ol></li>
</ol>3. elektrofizyolojik kayıtlar Beyin dilimleri
Not: Hipokampal sıçan dilimleri ulusal ve kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak hazırlanır.
<ol><li>
Hippocampus dilimleri hazırlanması
	<ol>
<li>Diseksiyon yapay beyin-omurilik sıvısı (dACSF) 124 mM NaCl 124, 2.5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2.5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glikoz ve 4 mM ile hazırlamak % 95'i O2 ve %5 CO2karışımı ile şişe benzin saccharose.</li>
		<li>Kayıt yapay beyin-omurilik sıvısı (rACSF) 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2.5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3ve 10 mM glikoz ile hazırlamak % 95'i O2 ve %5 CO2karışımı ile şişe zehirledi.</li>
		<li>% 2.5 isoflurane ve saf oksijen karışımı kullanarak fareler anestezi ve onları başını kesmek.</li>
		<li>Orta hat makas güzel bir ikili ile takip kafa derisi kesilmiş. Kafatasının orta çizgi boyunca temel doku zarar vermeden kes. Cımbızla kafatasını ve beyin kepçe için iyi bir spatula kullanın.</li>
		<li>Gazla dACSF çözüm RT, beyin koyun ve sol hipokampal oluşumu iyi bir spatula ile incelemek.</li>
		<li>Enine dilimler (400 µm kalınlığında) hipokampüs orta kısmından bir doku helikopter ile kesin ve kayıt odasına bir boyama fırça kullanımı ile aktarabilirsiniz. RT, dilimler için 45 dk korumak.</li>
		<li>Dilimleri ile 35 ° c gassed rACSF sıvı ve 1,5 mL/dk. hızında % 95'i O2 ve %5 CO2karışımı ile çözüm kabarcık. Not: Bu adımdan sonra dilimler elektrofizyolojik deneyler için hazır olur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tek nüfus spike kayıt
	<ol>
<li>Bir beyin dilim mikroskop monte edilmiş odanın içine yerleştirin.</li>
		<li>3 mL/dk ile rACSF oranında dilim sıvı.</li>
		<li>Borosilikat cam micropipette direnci ~ 2 MΩ sahip pipet çektirme ile çek. Not: Bu micropipette kayıt elektrot kullanılır ve elektrikle amplifikatör için bağlı.</li>
		<li>Micropipette 2 M NaCl içeren bir çözüm ile doldurun ve amplifikatör pipet yuvasına yerleştirin.</li>
		<li>Kayıt micropipette doğru micromanipulator kullanarak hipokampal dilimin CA1 bölgesindeki stratum pyramidale yerleştirin. Not: Konum şematik Şekil 7' de temsil edilir.</li>
		<li>Bir yalıtılmış bipolar platin/iridyum Elektrot tutucu sol micromanipulator üzerine yerleştirin. Not: Bu elektrot uyarılması elektrot kullanılır ve uyarıcı jeneratörü elektrikle bağlı.</li>
		<li>Stimülasyon elektrot Schaffer de¤erler doğru micromanipulator kullanarak hipokampal dilimin CA1 bölgesindeki yerleştirin. Not: Konum şematik Şekil 7' de temsil edilir.</li>
		<li>Geçerli nabzı uyarıcı Oluşturucu'yu kullanmamanızı stimülasyon elektrot her 30 teslim s (100 µs süreleri 10 µA başlayarak) ve bir nüfus artışı (PS) görünene kadar yavaş yavaş stimülasyon gücünü artırmak.</li>
		<li>Elde edilebilir en yüksek genlik % 45'i için karşılık gelen bir PS uyandırmak için uyarıcı güç ayarlayın. PSs 2.4 KHz filtre ve 20 KHz sinyal amplifikatör kullanarak sayısallaştırılmış.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çifte darbe inhibisyon
	<ol>
<li>Beyin dilimleri (adım 3.1) hazırlamak ve daha önce açıklandığı gibi devam edin (adımları 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>İki geçerli bakliyat (100 µs süreleri 20 ms aralığında) stimülasyon elektrot için her 30 teslim uyarıcı Oluşturucu'yu kullanmamanızı s. Maksimum genlik % 45'i için karşılık gelen bir PS uyandırmak için uyarıcı güç ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test bileşik
	<ol>
<li>Dilutions benzin ACSF test edilecek bileşiklerin yapmak böylece DMSO değil 0,1 daha yüksek son konsantrasyonu.</li>
		<li>DMSO bileşik çözüm daha aynı konsantrasyonu, kontrol çözümü ekleyin.</li>
		<li>(Adım 3.2) tek bir kayıt veya eşleştirilmiş-darbe (adım 3.3) PS Schaffer teminat elektrodlar tarafından uyarılmış her 30 s en az 30 dk için. PS şekli bu temel dönemde kararlı olmalıdır.</li>
		<li>Bir ölçek ile benzin rACSF test edilmesi için bahçedeki sabit bir konsantrasyon içeren hazır olun.</li>
		<li>Bu çözümle hipokampal dilim hala tek veya eşleştirilmiş-nabız PS kaydederken sıvı</li>
		<li>Bileşik etkisi kurtarma gazla rACSF bileşik olmadan dilimle ventriküler tarafından değerlendirmek. Not: geri dönüşümlü etkileri için PS bileşik uygulamadan temel dönemde gözlenen ilk şekli döner.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Veri Analizi
	<ol>
<li>Ortalama PS izlemeler sırasında 4 veri analiz yazılımı kullanarak bloklarını deneyde kaydetti.</li>
		<li>Ortalama izlemeler PS genlikleri ölçmek.</li>
		<li>10 dk bir bileşik ventriküler daha önce kaydedilen temel değerler yüzdesi olarak genlikleri normalleştirmek.</li>
		<li>± Sem demek gibi verileri hızlı</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li><li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+pharmacology+of+g-aminobutyric+acidA+receptor+subtypes.">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+functional+assay+for+characterization+of+g-aminobutyric+acidA+channel+modulators+using+cryopreserved+transiently+transfected+cells.">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li><li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes.">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li><li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels.">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li><li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinities,+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists,+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors.">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li><li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li><li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RO4938581,+a+novel+cognitive+enhancer+acting+at+GABAA+a5+subunit-containing+receptors.">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li><li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor-mediated+neurotransmission:+Not+so+simple+after+all.">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li><li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding.">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li><li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+of+the+GABAA+receptor+comprising+agonist+and+benzodiazepine+binding+sites.">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323 (2013).</li><li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands.">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li><li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+subtypes:+dissecting+their+pharmacological+functions.">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li><li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+channels:+from+subunits+to+functional+entities.">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li><li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus.">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li><li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells.">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, 485-504 (1999).</li><li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells.">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li><li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy.">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li><li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+slows+inactivation+kinetics+of+rat+recombinant+a1b2g2L+GABAA+receptors:+enhancement+of+GABAergic+transmission+despite+an+open-channel+block.">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li><li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , 17 (2004).</li></ol>

Yazarlar Frédéric Knoflach ve Maria-Clemencia Hernandez, F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel, İsviçre, bir ilaç şirketi çalışanlardır. Yazar Daniel Bertrand HiQScreen Sàrl 6, rte bir çalışandır de ilaç firmaları için tarama imkanları sağlayan Compois, 1222 Vésenaz Cenevre, İsviçre,.

Geliştirme roman bileşiklerin etkin bir ligand kapılı iyon kanalA GABA reseptörleri gibi birden fazla yaklaşımları kullanımını gerektirir. Genellikle, ilk adım genellikle bağlama deneyleri kullanarak yapılır; Ancak, bu tür ölçümleri bileşik veya onun hassas Farmakoloji fizyolojik etkinlik derecesinin yetersizdir. Özellikle, bir takımı bağlar bir bileşik geliştirmek veya işlevi inhibe veya bile (sessiz olmak) fonksiyonel etkisi üretmek (yani, onun işlevini değiştirme olmadan reseptör bağlamak). Böylece, fonksiyonel test tam bileşik bir karakterizasyonu için gereklidir.
Deneyleri bağlama: Bağlama tahlil büyük avantajı bu verimli bir şekilde örnekleri birkaç bin kadar değişen sayıda yapılabilir olduğunu ve etkin moleküller için bağlama affinities sağlar olduğunu. Burada açıklandığı gibi ilk adım bir yöntem istenen reseptör alt türlerinden değerlendirmesi için oluşturma oluşur. Yani, bağlama kesirleri veya tüm beyin yerli reseptörleri üzerinde yapılan iken, böyle bir yöntem belirli reseptör alt türlerinden, benzeşim belirlenmesi engeller. Bu, bu nedenle, ekran moleküllere rekombinant sistemleri istenen hedef kullanmak gereklidir. Günümüzde, istenen reseptör alt birim cDNAs hücre hatlarında, geçici veya sabit transfection reseptör alt türleri (Örneğin, GABAA α5β3γ2) ilgi ifade etmek için verimli ve güvenilir bir yöntem sunuyor. Geleneksel bağlama deneyleri yapmak kullanmak teknikleridir radioligands, ama günümüzde mevcut radyoaktivite (Örneğin, kantitatif floresan tabanlı-ligand taşıması) işleme rahatsızlık kaçının.
Bir ana bilgisayar sistemi işlevsel ifadede: Bir ana bilgisayar sistemindeki genlerin ifade etmek için kodlama dizisi ilgi yeterli promotors içeren bir plazmid eklenmesi gerekir. Genellikle, vitro mRNA sentezi için bakteriyel T7 veya T6 promotors kullanılır. CMV (sitomegalovirüs) veya eşdeğeri gibi ökaryot promotor tarafından cDNA ifade için faiz Gen transkripsiyonu düzenlenmiş olması gerekir. Günümüzde, birkaç plazmid (yani, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, PCI-neo, pcDNA), iki promotors de dahil olmak üzere, kullanılabilir bir vitro sentezi mRNA ya da Şekil 15' te gösterildiği gibi bir cDNA ifade izin vardır. Bir ifade GABAA reseptörlerinin sadakatle hücre hatları veya Xenopus yumurta elde edilebilir. İkinci en önemli avantajları bir endojen reseptör ifade, manipülasyonlar sadeliği ve mikro-enjeksiyon ve kayıtları için otomatik bir sistem kullanılabilirliğini eksikliği vardır. Bu protokol için açıklanan yordamları yaklaşık 7 dakika içinde 96 yumurta enjeksiyon sağlar ve hiçbir embriyolardan beceri gerektirir otomatik sistem etkinliğini göstermektedir. Xenopus tek yumurtalıktan 10.000 – 30.000 yumurtalar arasında içerir hatırlayarak, bu hücre ölçümleri, çok sayıda tek bir hazırlık yapılabilir açıktır. Bir ifade kullanarak cDNA enjeksiyonları yapılabilir gibi Ayrıca, bağlama deneyler için geliştirilen genleri ilgi içeren aynı plazmid ezelî belgili tanımlık lüzum daha da moleküler biyoloji işlevsel bir karakterizasyonu için kullanılabilir manipülasyonlar.
Onun büyüklüğü ve yüksek yüzey anlatım göz önüne alındığında, bir tek yumurta yaklaşık 35 mm Petri kabına konfluent hücrelere eşdeğerdir reseptörleri sayısını verir. Ancak, bir yumurta hazırlık ve enjeksiyon gösteren bir hücre kültürünü maliyetinin bir kısmını deneyler özel bir kültür ortam ve steril manipülasyonlar gerekmez. Bir kaç picoamperes (10-12) tek bir GABAA kanal aktivasyonu verimleri ve ilâ microampere (10-6) onlarca arasında değişen akımlar kolayca birkaç milyonlarca eşlik eden etkinliğini doğruladı bir tek yumurta içinde kaydedilir reseptörleri sırasında tek bir yanıt.
İlk adımda ligand kapılı iyon kanalları karakterizasyonu kez reseptörlerinin belirgin benzeşme belirlenmesidir. Tarihte gerek deneyler bir dizi kısa agonist testi uygulayarak ve genliği uyarılmış geçerli veya belirli durumlarda, agonist konsantrasyon logaritması bir fonksiyonu olarak (AUC) eğri altındaki alan komplo oluşur. Farklı plazmid konsantrasyonları ve yumurtalar aynı toplu oranı microinject kolayca mümkün olduğu gibi bu sistem ifade böyle bir karakterizasyonu için özellikle uygundur. Ayrıca, bir toplu iş toplu iş karşılaştırma istikrar için farklı EC50s yüksek derecede ortaya koydu. Alt birim kompozisyon reseptör'ın belirgin benzeşme hakkında etkisi kolayca Şekil 10örneği olarak bir örümcek arsa kullanarak görüntülenir.
Xenopus yumurta elde iki elektrot gerilimi kelepçe sonuçlarını sık sık düzeltme eki EKG mandalları kullanılarak yapılan kayıtları ile karşılaştırılır. Bu iki sistem arasında detaylı bir karşılaştırma gitmek bu işin kapsamı ötesinde gitti ise bir kaç puan incelenebilir. Hücrelerde bir yama kelepçe hızlı ilaç uygulaması ile biyofiziksel bir karakterizasyonu için avantajları sunarken, gereksinimleri daha bu iki elektrot kayıtları Xenopus yumurta daha karmaşıktır. Zorluk ilk ve önemsiz olmayan bir hücre kültürü, bir geçici veya sabit transfection gerekliliği ve istenen yapı ifade eden hücreler tanımlaması ile verilen bir protein ifadesidir. Buna ek olarak, kabul hücre endojen ifadede mümkün katkısını incelemek için vazgeçilmezdir. Ayrıca, bir yama kelepçe kayıt o kişi de, örneğin, mühür kalitesini değerlendirmek için deneme sırasında yeterli bir analiz yapmak gerekir iken yüksek büyütme mikroskop altında embriyolardan yapmak yetenekli bir kişi gerektirir, erişim direnç vb aksine, kayıt, özellikle bir elektrofizyolojik otomatik bir sistem kullanarak bir iki elektrot gerilimi kelepçe herhangi bir özel beceri gerektirmez ve Laboratuvar teknisyenleri tarafından yapılabilir.
Elektrofizyolojik bir set-up edinme zaman maliyet dikkate kesinlikle dikkatli bir şekilde çözümlenmesi gereken önemli bir faktördür. Otomatik bir sistem maliyeti nispeten yüksek olmakla birlikte, örneğin, daha yakın bir karşılaştırma yükleme tam elektrofizyolojik teçhizat gibi iyi micromanipulators, bir dürbün lens, bir amplifikatör, bir perfüzyon donanımları satın içerir ortaya çıkarır Sistem ve ayrıca veri alınıyor ve bir çözümlemesini süre bir anti-titreşim tablo. Bir iki elektrot gerilimi kelepçe koymak-yukarıya karşı bir yama kelepçe koymak-yukarıya arasında bir maliyet karşılaştırma daha da farklılıklar ortaya koymaktadır. Ayrıca, otomatik bir sistem tam otomatik ekipman avantajı sunuyor ve gece gündüz katılımsız çalışır.
Bir bileşik farmakolojik özelliklerini yazam├╜yor reseptör, eylem tarafından belirlenir. Örneğin, rekabetçi inhibitörleri aynı bağlama cebinizde veya orthosteric sitesi, girebilirsiniz molekülleri şunlardır agonist kendisi bir yarışma neden olur. Sigara rekabetçi inhibitörleri, girebilir ve iyonik gözenek örneğin engellemek, başka bir sitede ve bir ligand kapılı iyon kanalı durumunda etkileşerek reseptörleri inhibe bileşiklerdir. Etkileşim farklı mekanizmaları incelemek için bu işin kapsamı gitmek istiyorum, ama daha fazla bilgi farmakolojik bir ders kitabından ve/veya Bertrand ve Bertrand'ın22gibi diğer işten elde edilebilir.
Allosteric modülatörler söz konusu olduğunda, orthosteric sitesi, ama durum molekülün farklı bir sitede bileşik bağlar enerji bariyeri aktif ve diğer devletler arasında değiştirir. Pozitif allosteric modülatörler (PAMs) enerji bariyeri etkin duruma dinlenme--dan azaltmak bileşiklerdir ve bu nedenle, agonist etkisini artırmak. Olası PAM etkileri tanımlamak için bu, bu nedenle, Eğer bileşik bir maruz agonist yanıtı geliştirir ve eğer öyleyse, hangi konsantrasyon de belirlemek gereklidir. Şekil 11 ve Şekil 14 sunulan deneyler başarıyla GABAA reseptörleri, PAMs karakterizasyonu için kullanılabilir protokolleri göstermektedir.
Bazı durumlarda, tek başına PAM maruz reseptörleri etkinleştirmek yeterli olabilir. Bu tür etkinlikler burada sunulan Deneysel protokol hafif bir değişiklik tarafından belirlenebilir. Yani, modülatör ortak bir uygulama GABA maruz sırasında kullanmak yerine, protokol ilk uygulama için tek başına ve sonra huzurunda GABA bileşik değiştirilebilir. Doğrudan agonist etkinlik karakterizasyonu bileşik tarafından uyarılmış ve GABA uyarılmış geçerli karşılaştırıldığında yanıt genliği tespiti yapılacak.
Şekil 7' de gösterildiği gibi beyin dilimler halinde yapılan deneylerde daha fazla hayvan modellerinde ve klinik karşı yol boyunca gitmeden önce kesin bir inhibitör devre yerel reseptörleri, bileşik faaliyet onaylamak için kullanılır. Nispeten basit veri kayıt ve analiz Protokolü PS genlik fark düzenleyici etkileri değerlendirilerek birden çok bileşikleri sıralamasını sağlar. GABA sisteme ilgili olmayan bileşikler spesifik olmayan etkileri (PS şekil değişiklikleri gözlendiğinde algılananÖrneğin) de kullanabilirsiniz. Doğrudan, GABAergic neurotransmission bu gibi durumlarda bütün hücreli yama klemp tekniği8kullanarak inhibitör postsinaptik akımları (IPSCs) bileşiklerin etkisi ölçülerek tespit edilebilir.

Burada, aktif bileşikler keşfi için protokolleri GABAA reseptörleri Fizyoloji ve farmakoloji bağlama mevcut. Ara roman molekülleri GABAA reseptörleri için belirli, burası tanımlamak için çok önemli, kesin olarak mümkün, alt türü faiz ve özgüllük yeni tanımlanan bileşiklerin değerlendirilmesi (Örneğin, incelenmek üzere, Rudolph görmek ve Knoflach1veya Sieghart2). İlaç keşif ve ulaşılması gereken adımları tipik bir yoldaki Şekil 1' de gösterilmiştir.
Bağlama deneyleri olmuştur ve hala büyük ölçüde ilaç keşfi ilk aşama olarak kullanılır. GABAA reseptörleri söz konusu olduğunda, onlar nerede uyuşturucu tedavi amaçlı yararlı ve güvenli bağlamak benzodiazepin bağlama siteye reseptör bağlamak bileşenleri tanımlamak için optimize edilmiştir. Fluorometrik görüntüleme plaka okuyucu (FLIPR) membran potansiyeli kırmızı boya tabanlı deneyleri3, kullanarak diğer teknikleri, bileşiklerin onların istenmeyen yan etki profili nedeniyle daha az tercih başka sitelere bağlamak barbitüratlar gibi algılamak. Buna ek olarak, kullanılan boyar maddeler doğrudan GABAA reseptörleri, böylece bu deneyleri ilaç bulma4için yarar sorgulama etkinleştirebilirsiniz. Deneyleri bağlama yalnızca belirli bir bileşik belirli reseptör sınıfbağlayabilirsiniz kanıt sağlayabilir. İn vitro deneyleri ile hücre zarlarında seçici insan GABAA α5β3γ2 reseptör ligandlar tanımlamak için kullanılır. İnsan GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 ve α3β3γ2 reseptörleri ifade geçici transfected HEK293 hücre zarlarında bu deneyleri için hazırlamak için kullanılır. Ligandlar etkisini membran reseptörleri ([3H] flumazenil bağlama bir inhibisyonu) bağlı [3H] flumazenil mercek ölçerek algılanır. Bu teknik büyük avantajı bileşik bağlama benzeşme reseptör ilgi, hızlı ve verimli belirlenmesi faiz reseptör sağlanan olduğunu.
Fonksiyonel çalışmalar bileşiklerin fonksiyonel etkinlik değerlendirmek ve fizyolojik ve farmakolojik bir açıklama reseptörleri bileşiklerin bağlama neden mekanizmaları teklif etmek gereklidir. Bugün, fonksiyonelA GABA reseptörleri pseudosymmetry iyonik gözenek ve derlemesinden sonucu beş özdeş alt birimleri tarafından kurulmuş bir eksen çevresinde beş alt birimleri Meclisi sonucu İyi tanınan biridir. GABAA reseptörleri çoğu iki veya daha fazla farklı alt birimleri oluşur. Büyük beyin GABAA reseptör, örneğin, bir stoichiometry 2, 2 ve 1 α1, B2 ve γ2 altbirimden sırasıyla oluşan5,6. Xenopus yumurta veya HEK293 hücreleri gibi bir ana bilgisayar sistemi rekonstitüsyon hızla reseptörlerinin farmakolojik özellikleri keşfetme imkanı sunuyor.
Bileşiklerin farmakolojik özellikleri sonra beyin dilimleri7ekstraselüler kayıtları ile incelenmiştir. Bu yöntem bileşikleri etkisi neurotransmission bir keşif ve kapaklı ifade sistemlerinde yerel reseptörleri genel düzeyde belirlenen bileşikler fonksiyonel etkileri onaylamak için etkili bir yol sağlar nöronal ortamı. GABAergic neurotransmission Ayrıca moleküler düzeyde inhibitör postsinaptik akımları (IPSCs)8bileşiklerin etkisi ölçülerek tespit edilebilir. Ama burada kullanılan ve bütün hücreli yama kelepçe kayıtları Beyin dilimleri içinde temel protokolü daha ayrıntılı ve daha düşük işlem hacmi verim.
Son olarak, güçlü ve zayıf yönlerini α5β3γ2 seçici ligandlar tanımlanması için kullanılan cascade eleme vitro farklı teknikleri ve içsel sınırlamaları perspektif içinde ele alınmıştır. Bu eser uzman ve farklı vitro yaklaşımlar ile birlikte yararlı bir daha gözden geçirme bu ligand kapılı iyon kanalları yeni modülatörler keşfi mücadele için kullanılanA GABA reseptörlerinin alanında uzman sağlamalıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1024px;" width="1023">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">General equipment</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96 well cell harvester -(Filtermate 196)&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>To filter membranes with bound radioligand</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Microplate Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR)</td>
			<td>Packard</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">Vial Scintillation and Luminescence counter</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Liquid&#160; handler (Biomek 2000)</td>
			<td style="width:169px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To prepare compound dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:465px;">Vortex (Vortex Genie 2)</td>
			<td>Scientific industries Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To mix compound stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Tissue homogenizer (Polytron PT1200E)</td>
			<td>Kinematica AG</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To resuspend the membrane preparations</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">XLfit5 software</td>
			<td style="width:169px;">Microsoft Excel 
			&#160;add-on by IDBS</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Curve fitting software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Smart Pull</td>
			<td>UniPix</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Electrode Puller</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RoboInject</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Injection (Xenopus Oocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">HiClamp</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMining</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">DataMerger</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>Data Processing Software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Digidata 1550</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Low noise data acquisition system</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">CyberAmp 380 or equivalent</td>
			<td style="width:169px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Programmable Signal Conditioner</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">pClamp program suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">Software for data acquisition and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Antivibraton table&#160;</td>
			<td style="width:169px;">TMC</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To avoid microelectrode vibrations&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Patchstar Micromanipulators</td>
			<td style="width:169px;">Scientifica</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To accurately position microelectrodes in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Faraday Cage&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;">To isolate recordings from noise</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td style="width:169px;">Campden Instruments LTD&#160;</td>
			<td></td>
			<td>To prepare brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Borosilicate glass micropipette&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Warner Instruments</td>
			<td>GC150TF-10</td>
			<td style="width:253px;">To record extracellular potentials in brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode</td>
			<td style="width:169px;">World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td style="width:253px;">To stimulate the brain slices with current</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stimulus generator for current and voltage driven stimulation</td>
			<td>MultiChannel Systems</td>
			<td>STG4000</td>
			<td style="width:253px;">Delivers the current to the stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Plasticware</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microtiter plate round bottom</td>
			<td style="width:169px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">#3365</td>
			<td>Used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2&#181;m poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Packard&#160;</td>
			<td>#6005174</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">50 mL Tubes</td>
			<td style="width:169px;">Falcon&#160;</td>
			<td>#352070</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120086</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Safe-lock tubes 2 mL</td>
			<td style="width:169px;">Eppendorf</td>
			<td>#0030 120094</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Shipping tubes 180ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Semadeni Europe AG&#160;</td>
			<td>#3722</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Pony vial Polyethylene 6ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#6013329</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Top Seal&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>#60051859</td>
			<td style="width:253px;">used for the binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>BELLCO # 1965-00100</td>
			<td>Spinner Flask</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Conical)</td>
			<td style="width:169px;">Thermo Scientific Milian</td>
			<td>56368</td>
			<td style="width:253px;">Injection plate for the oocytes</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">96&#160; Well Plate (Flat bottom)</td>
			<td style="width:169px;">Corning (Vitaris Switzerland)</td>
			<td>3364-cor</td>
			<td style="width:253px;">Compound Plate for the HiClamp</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Hilgenberg (Germany)</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:253px;">borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">RNA preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ambion mMessage mMachine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>for the in vitro synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4&#176;C.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Stock solution of test compounds 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Diazepam 4mM in DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Microscint 40&#160;</td>
			<td>Packard&#160;</td>
			<td>#6013641</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Ultima Gold&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Perkin Elmer&#160;</td>
			<td style="width:136px;">#6013329</td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">MS-222</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5040</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">AB/AM</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # A5955</td>
			<td>antibiotics / antimycotics</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Collagenase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # C1030</td>
			<td>Collagenase Type I</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Rnase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td>Sigma # R2020-250 mL</td>
			<td>RNaseZAP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">EndoFree Plasmid maxi Kit</td>
			<td style="width:169px;">Qiagen</td>
			<td>Qiagen # 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.)</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Membranes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;">Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: &#945;1&#946;3&#947;2, &#945;2&#946;3&#947;2, &#945;3&#946;3&#947;2, &#945;5&#946;3&#947;2. See Ballard et al 2009 for detailed methods.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for binding assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the discovery of novel compounds modulating a gamma-aminobutyric acid receptor type a neurotransmission

Adım adım bir protokol filtreleme için gama-aminobütirik maddeler ve birleşimler bu el yazması hediye asit yazın (GABAA) reseptörleri ve kimliği roman moleküller preklinik deneyleri bir vitro rekombinant üzerinden aktif doğru kullanımı farmakolojik etkileri kemirgen beyin dilimleri yerel reseptörleri, takımı. Reseptör benzodiazepin sitesinde bağlayıcı bileşikler için radioligand bağlama deneyleri hücre zarlarında büyük GABAA alt türlerini ifade üzerinde geliştirme oluşur bir birincil ekranı ayarlamak için ilk adımdır. O zaman, kemirgen ve insan GABAA reseptörleri Xenopus yumurta veya HEK 293 hücreleri Contegra ifade yararlanarak, elektrofizyolojik deneyleri içinde farklı reseptör fizyolojik özelliklerini keşfetmeye mümkün mü alt türlerini ve tanımlanan bileşiklerin farmakolojik özellikleri. Xenopus oosit sistemi burada, yumurta ve onların mikroenjeksiyon ile iki elektrot gerilimi kelepçeler kullanılarak farmakolojik karakterizasyonu kadar farklı mRNA izolasyonu ile başlayan sunulacaktır. Son olarak, kemirgen beyin dilimler halinde yapılan kayıtları ikincil bir fizyolojik test etkinliği iyi tanımlanmış bir nöronal devre onların yerli reseptörleri, moleküllerin değerlendirmek için kullanılan açıklanacaktır. Hücre dışı kayıtları birden çok nöron nüfus yanıt-e doğru kullanma içinde ilaç uygulama ile birlikte gösterilen.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission at JoVE.com

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Burada, GABAA reseptörleri, fizyoloji ve farmakoloji bağlama, aktif bileşikler keşfetmek için protokolleri mevcut.

Bir Neurotransmission roman bileşikleri bir gama - aminobütirikasit reseptör oransal keşfi için yöntemleri yazın

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

methods-for-discovery-novel-compounds-modulating-gamma-aminobutyric

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Anxiolytics, Sedatives and Hypnotics

SCIENTISTS IN ACTION

13.4K Görüntüleme.  Roche Innovation Center Basel. Burada, GABAA reseptörleri, fizyoloji ve farmakoloji bağlama, aktif bileşikler keşfetmek için protokolleri mevcut.

Video: Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction. Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in animal research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. For this study, we used a novel approach to studying drug reinforcement in rats by combining traditional CPP and self-administration methodologies. We assembled an apparatus using two Med Associate operant chambers, sensory stimuli, and a Plexiglas-constructed neutral zone. These modifications allowed our experiments to encompass motivational aspects of drug intake through self-administration and drug-free assessment of drug/cue conditioning strength with the CPP test. In our experiments, rats self-administered cocaine (0.75 mg/kg/inj, i.v.) during either four (e.g., the "short-term") or eight (e.g., the "long-term") alternating-day sessions in an operant environment containing distinctive sensory cues (e.g., olfactory and visual). On the alternate days, in the other (differently-cued) operant environment, saline was available for self-infusion (0.1 ml, i.v.). Twenty-four hours after the last self-administration/cue-pairing session, a CPP test was conducted. Consistent with typical CPP findings, there was a significant preference for the chamber associated with cocaine self-administration. In addition, in animals undergoing the long-term experiment, a significant positive correlation between CPP magnitude and the number of cocaine-reinforced lever responses. In conclusion, this apparatus and approach is time and cost effective, can be used to examine a wide array of topics pertaining to drug abuse, and provides more flexibility in experimental design than CPP or self-administration methods alone.

Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. In this report, we combined traditional CPP and self-administration methods as a novel approach to studying drug reinforcement and addiction in rats.

İlaç Takviye için yeni cihaz ve Yöntem

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Nörobilim

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Dinamik Kelepçe Tekniği ile Sıçan orta beyin dopaminerjik nöronlar NMDA Reseptör İletkenlik Uygulama

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Kullanarak Bileşiklerin Biyoaktivite için eşli Nanoinjection ve Ekran için Elektrofizyoloji Testi Drosophila melanogaster Dev Elyaf Sistemi

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Bir Fare Modelinde İntravenöz Öz Yönetim Yöntemleri

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

İnsan orta beyin için yüksek çözünürlüklü Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Yöntemleri

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Antipsikotik İlaçların Etki Mekanizmaları incelenmesi için Yöntemleri<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to degeneration and injury of small-diameter sensory neurons, referred to as small fiber neuropathy. Present animal models of small fiber neuropathy affect both large- and small-diameter sensory fibers and thus create a neuropathology too complex to properly assess the effects of injured small-diameter sensory fibers. Therefore, it is necessary to develop an experimental model of pure small fiber neuropathy to adequately examine these issues. This protocol describes an experimental model of small fiber neuropathy specifically affecting small-diameter sensory nerves with resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), through a single dose of intraperitoneal injection, referred to as RTX neuropathy. This RTX neuropathy showed pathological manifestations and behavioral abnormalities that mimic the clinical characteristics of patients with small fiber neuropathy, including intraepidermal nerve fiber (IENF) degeneration, specifically injury in small-diameter neurons, and induction of thermal hypoalgesia and mechanical allodynia. This protocol tested three doses of RTX (200, 50, and 10 &#181;g/kg, respectively) and concluded that a critical dose of RTX (50 &#181;g/kg) is required for the development of typical small fiber neuropathy manifestations, and prepared a modified immunostaining procedure to investigate IENF degeneration and neuronal soma injury. The modified procedure is fast, systematic, and economic. Behavioral evaluation of neuropathic pain is critical to reveal the function of small-diameter sensory nerves. The evaluation of mechanical thresholds in experimental rodents is particularly challenging and this protocol describes a customized metal mesh that is suitable for this type of assessment in rodents. In summary, RTX neuropathy is a new and easily established experimental model to evaluate the molecular significance and intervention underlying neuropathic pain for the development of therapeutic agents.

This study establishes an experimental model of pure small fiber neuropathy with resiniferatoxin (RTX). A unique dose of RTX (50 &#181;g/kg) is optimal for developing a small fiber neuropathy model that mimics patient characteristics and could help investigate the nociceptive molecular significance underlying neuropathic pain.

Saf küçük Fiber nöropati bir fare modeli ile geçici reseptör potansiyel Vanilloid tip 1 Ultrapotent Agonist kurulması

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...