Il nostro protocollo può essere utilizzato per migliorare la qualità e la quantità dei dati di espressione genica generati da campioni di RNA derivati da FFPE, specialmente in campioni di qualità non ottimale. Questa tecnica valuta la qualità dell'RNA all'interno dei campioni di tessuto FFPE e consente l'ottimizzazione della loro elaborazione a valle per migliorare la quantità e la qualità dei dati di sequenziamento del campione. Questo metodo consente la caratterizzazione completa di una trascrizione in campione biologico e clinico e può fornire informazioni su elementi funzionali del genoma nello sviluppo e nella malattia.
La degradazione dell'FFPE-RNA e la selezione dei metodi per il QC del campione, la preparazione della libreria e l'analisi dei dati possono essere tutti molto difficili. Sii meticoloso quando selezioni i metodi giusti e i controlli appropriati. La dimostrazione visiva consente agli spettatori di osservare le piccole modifiche sottili e le precauzioni necessarie durante la pianificazione, la valutazione e il processo di sequenziamento, in particolare per campioni FFPE mal conservati.
Per verificare la qualità del campione di RNA, eseguire il campione su un sistema RNA QC secondo le istruzioni del produttore e utilizzare l'appropriato software di bioanalisi per analizzare la distribuzione dei frammenti di RNA all'interno del campione e calcolare la proporzione di frammenti più lunghi di 100 e 200 nucleotidi. In base alle metriche QC, identificare i campioni con meno del 40% dei frammenti più lunghi di 100 nucleotidi per consentire l'esclusione di questi campioni dall'elaborazione. Per il sequenziamento, scongelare i kit di reagenti di sequenziamento appropriati in base ai parametri di corsa in un bagno d'acqua a temperatura ambiente e posizionare il vassoio del reagente a quattro gradi Celsius dopo lo scongelamento.
Posizionare il pacchetto cella di flusso a temperatura ambiente per 30 minuti. Durante il riscaldamento del pacchetto, aprire l'applicazione Illumina Experiment Manager e selezionare Crea foglio di esempio. Selezionate il sequencer da utilizzare e fate clic su Avanti (Next).
Immettere il codice a barre del kit di reagenti e gli altri parametri appropriati del flusso di lavoro. Quindi caricare un foglio di esempio creato in base ai criteri della sequenza Illumina. Per preparare la libreria di esempio e la libreria di controlli PhiX, denaturare e diluire le librerie alle concentrazioni appropriate e mescolare le librerie di controllo sample e PhiX per ottenere un rapporto volume di controllo PhiX del 5%.PhiX.
Quando le celle di flusso sono pronte, rimuovere l'involucro, pulire la superficie del vetro con una salvietta alcolica priva di pelucchi e asciugare il vetro con un tessuto da laboratorio a bassa pelucchi. Rimuovere la cartuccia del reagente dallo stoccaggio di quattro gradi Celsius e invertire la cartuccia cinque volte per mescolare i reagenti. Toccare delicatamente la cartuccia sul banco per ridurre le bolle d'aria e caricare il campione denaturato e diluito nella cartuccia del reagente nel serbatoio designato.
Caricare la cella di flusso, la cartuccia tampone e la cartuccia del reagente nel sistema. Quindi eseguire un controllo automatico ed esaminare l'output per assicurarsi che i parametri di esecuzione superino il controllo del sistema. Al termine del controllo automatico, selezionare Inizia per iniziare l'esecuzione del sequenziamento.
Per visualizzare i risultati qc di pre-elaborazione e qc post-allineamento, eseguire multi-QC per generare un report aggregato in formato HTML. Per determinare gli effetti batch e valutare la mappa di qualità del set di dati specificato, utilizzare uno script R per eseguire un'analisi dei componenti principali. L'analisi di correlazione del campione può quindi essere effettuata utilizzando la correlazione di Pearson tra campioni diversi.
La stima della proporzione di frammenti più lunghi di 100 nucleotidi è più utile di una stima dei frammenti più lunghi di 200 nucleotidi perché è più sensibile per misurare con precisione la proporzione di frammenti più piccoli per campioni di RNA altamente degradati. Dato l'alto grado di degradazione nel set di campioni, si consiglia un metodo di preparazione totale della libreria di RNA. Ad esempio, qui vengono mostrate librerie di sequenziamento preparate da quattro diversi campioni.
Qui vengono visualizzate le panoramiche della qualità di sequenziamento dei file FastQ non elaborati e del contenuto dell'adattatore di esempio. Lo screening FastQC può aiutare a rilevare contaminazioni come la contaminazione batterica o del topo all'interno dei campioni. L'allineamento STAR può essere utilizzato per determinare la proporzione di letture mappate al genoma di riferimento, la percentuale di letture mappate in modo univoco al genoma di riferimento e la proporzione di letture che non sono state mappate o che sono state mappate a più loci.
Le statistiche della scheda e della RSeQC possono essere utilizzate per determinare la percentuale di RRNA messaggero, basi introniche e intergeniche presenti nelle letture mappate. Per queste analisi rappresentative, alcune librerie degradate avevano un tre pregiudizio primo in cui più letture erano mappate più vicino ai tre primi che ai cinque primi. Inoltre, l'analisi dei componenti principali può essere eseguita per determinare la percentuale della variazione totale catturata dai componenti principali per le repliche biologiche di ciascun campione.
Fare attenzione a evitare la degradazione del campione, preparare repliche e più mani per ogni campione, utilizzare le metriche appropriate per valutare la qualità del campione e utilizzare il metodo di preparazione della libreria corretto. Utilizzando questa metodologia, studi NGS più grandi possono essere eseguiti con campioni FFPE precedentemente inutilizzabili con tempi e condizioni di conservazione variabili per ottenere informazioni dettagliate su una varietà di stati di malattia diversi. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per studiare i grandi archivi esistenti del campione FFPE con ricche informazioni cliniche e può migliorare notevolmente gli studi sul cancro basati sulla popolazione.
