Si ringraziano il Dr. Wei Qi He (Soochow University, Suzhou, Cina) e Dr. Yan Ning Qiao (Shaanxi Normal University, Xi ' an, Cina) per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da National Natural Science Foundation of China (Grant 31272311, 81373295 e 81473420) e il progetto, finanziato le priorità programma sviluppo di Jiangsu istruzione superiore istituzioni accademiche (Grant No. ysxk-2016).

Manipolazioni degli animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università modello animale ricerca centro di Nanchino.
1. soluzione preparazione
<ol><li>Preparare la soluzione di Tyrode HEPES (H-T) utilizzando 137,0 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1mm MgCl2∙6H2O, 5,6 mM D-glucosio e 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.</li>
	<li>Preparare soluzione HEPES-Tyrode senza calcio (Ca2 +-libero H-T) utilizzando 140,6 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5,6 mM D-glucosio e 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.</li>
	<li>Preparare soluzione HEPES-Tyrode utilizzando 124 mM KCl (alta K+) utilizzando 15,7 mM NaCl, 124,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1mm MgCl2∙6H2O, 5,6 mM D-glucosio e 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.</li>
</ol>2. esperimento preparazione
<ol><li>Preriscaldare il H-T e soluzioni High-K+ usando un bagno di acqua di 37 ° C.</li>
	<li>Accendere il computer, di sistema di myograph e di hardware di acquisizione dati.</li>
	<li>Riempire con cura tutte le myograph camere con 5 mL di soluzione di H-T ogni.</li>
	<li>Riempire due capsule di Petri con 20 mL di 4 ° C H-T e Ca2 +-free soluzioni H-T, rispettivamente e conservare il ghiaccio.</li>
	<li>Riempire un piatto Petri ricoperto di 10 cm con 20 mL di soluzione di H-T e mantenerla a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. dissezione dell'arteria mesenterica Mouse
<ol><li>Eutanasia di un mouse di C57BL/6J 12-week-old 8 femmina o maschile di dislocazione cervicale. Pin il mouse verso il basso con l'addome rivolto verso l'alto.</li>
	<li>Inumidire l'addome con etanolo al 70%. Quindi, tagliare la pelle con le forbici lungo la linea mediana ventrale dall'inguine e fare incisioni dall'inizio della prima incisione verso il basso per le gambe su entrambi i lati. Tirare la pelle indietro su entrambi i lati; fare delle incisioni simili per aprire il peritoneo.</li>
	<li>Utilizzando le forbici, tagliare dell'esofago, del colon e altri tessuti connettivi per isolare completamente il tratto gastrointestinale con alimentazione sistema vascolare dal corpo.</li>
	<li>Con il forcipe, spostare il segmento isolato nel piatto contenente il freddo H-T preparata al punto 2.4 e sciacquare delicatamente il tessuto in H-T soluzione diverse volte per lavare via il sangue.</li>
	<li>Trasferire il segmento isolato in di Petri rivestito preparata al punto 2.5 ed eseguire la dissezione dell'arteria mesenterica a temperatura ambiente.</li>
	<li>Appianare la stomaco, digiuno, dell'ileo e cieco in senso orario, e pin lo stomaco e l'intestino cieco sul lato sinistro e destro, rispettivamente.</li>
	<li>Allungare il letto di vascolarizzazione mesenterica e difficoltà dell'intestino con i perni per esporre le arterie mesenteriche dissecate. Nota: In queste condizioni, le arterie sono in cima le vene.</li>
	<li>Attivare la sorgente di luce di trasmissione di un microscopio stereoscopico e sezionare le arterie sotto il microscopio. Assicurarsi che l'intero tessuto sia immerso nella soluzione.</li>
	<li>Morsetto del tessuto adiposo intorno le arterie con il forcipe e isolare le arterie, tagliando tutti i tessuti connettivi con forbici di dissezione. Evitare di ferirsi le arterie.</li>
</ol>4. arteriosa di montaggio
<ol><li>Trasferimento e immergere l'albero dell'arteria mesenterica nel freddo Ca2 +-libera soluzione H-T (preparata al punto 2.4) fissando le arterie in eccesso con il forcipe.</li>
	<li>Tagliare una porzione di 1.4 millimetri dell'arteria prossimale alla parete intestinale di un arcade mesenterica e utilizzare due pinze per aprire entrambi i lati di questo segmento dell'arteria con attenzione.</li>
	<li>Preparare due segmenti di filo di acciaio inossidabile 2,5 cm di lunghezza e metterli nel piatto stesso.</li>
	<li>Serrare delicatamente un'estremità dell'arteria usando il forcipe e inserire delicatamente due fili nel lumen dell'arteria uno ad uno con l'aiuto di un'altra pinza. Assicurarsi che i fili sono mantenuti dritti e non toccano l'endotelio.</li>
	<li>Utilizzando due pinze, morsetto simultaneamente i due fili di acciaio di fuori della nave filettata e trasferire con cautela la nave da di Petri ad una camera di myograph precedentemente riempita con H-T soluzione (punto 2.3).</li>
	<li>Avvitare le ganasce a pezzi per fare spazio per il montaggio. Entrambi i lati di uno dei due fili inseriti utilizzando due pinze di serraggio e porre il recipiente nello spacco della mascella (Figura 1A).</li>
	<li>Eseguire il wrapping di entrambi i lati del filo bloccato intorno viti della mascella collegato al micrometro (Figura 1B).</li>
	<li>Fissare la vite a sinistra ruotando in senso orario. Raddrizzare il filo utilizzando la pinza destra, quindi fissare la vite destra ruotando in senso orario (Figura 1). Assicurarsi che il recipiente sia sempre all'interno dell'intercapedine della mascella, ma non toccare la mascella per evitare danni.</li>
	<li>Chiudere le due ganasce utilizzando il micrometro (Figura 1). Assicurarsi che le due mascelle sono abbastanza vicina ma che non entrino in contatto tra loro e che il filo non fissato sia nella parte superiore il filo fisso.</li>
	<li>Con attenzione utilizzando la pinza destra, piegare il filo svitato all'angolo della mascella collegata per trasduttore di forza e avvolgerlo in senso orario intorno alla vite di destra (Figura 1E). Quindi, fissare la vite. Ripetere questo passaggio sul lato sinistro del filo e fissare la vite sul lato sinistro (Figura 1F).</li>
	<li>Spostare le ganasce leggermente divaricate ruotando attentamente il micrometro (Figura 1). Evitare l'allungamento della nave. Utilizzare pinze per spostare il filo sul lato di micrometro sul piano orizzontale del filo sul lato trasduttore. Ruotare delicatamente il micrometro affinché il divario tra le due ganasce può ospitare solo due fili.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 4.2 – 4,11 per montare le arterie in altre sezioni. Collegare tutti gli alloggiamenti per le attrezzature, coprire gli alloggiamenti, allegare il rifornimento di ossigeno al 100% e una sonda di temperatura e iniziare il riscaldamento a 37 ° C. Aprire il software di creazione di grafici e premere il pulsante Start sulla finestra di Visualizzazione grafico per avviare la registrazione.</li>
	<li>Equilibrare per circa 20 min.</li>
</ol>5. normalizzazione
Nota: Al fine di standardizzare le condizioni sperimentali e per ottenere affidabile reattività fisiologica dei vasi, una procedura di normalizzazione è necessario15. Secondo il rapporto tra la forza attiva e la circonferenza interna della nave, il sistema di myograph di filo ha un programma di normalizzazione standard per valutare la circonferenza interna (IC) del serbatoio montato5,8, 9. Brevemente, per calcolare IC (µm), leggere il micrometro e il valore di input come il valore di X e il trasduttore uscita forza, cioè, che riposa tensione parietale (mN/mm), come il valore di Y. Il programma tornerà una curva di (X, Y) e calcolare l'IC corrispondente ad una pressione transmurale di 100 mmHg (IC100). La nave è impostata alla circonferenza interna normalizzata (IC1) quando è massima la capacità di risposta attiva.
<ol><li>Impostare le forze a zero per tutti i canali sul dispositivo ed equilibrare per un altro 1-2 min.</li>
	<li>Selezionare impostazioni di normalizzazione dal "menu di DMTe impostare i parametri come segue: Calibrazione dell'oculare (mm/div): 0,36; Pressione (kPa) di destinazione: 13,3; IC1/IC100: 0,9; Online con una media di tempo (secondi): 2; Tempo (secondi) di ritardo: 60. Fare clic sul pulsante OK per chiudere la finestra Delle impostazioni di normalizzazione di DMT .</li>
	<li>Selezionare il canale di interesse dal menu di DMT per aprire una finestra di normalizzazione di DMT per il canale corrispondente. Immettere i valori costanti nella finestra come segue: tessuto punti finali a1: 0,1; Tessuto i punti finali a2: 4; Diametro del filo (µm): 40. La finestra Visualizza la lunghezza della nave calcolato come 1,40 mm.</li>
	<li>Leggere il micrometro di camera del tessuto appropriato. Immettere il valore nella casella lettura micrometro e fare clic sul pulsante Aggiungi punto . Questo valore è il valore iniziale di X (X0). Dopo un tempo di ritardo 60 s, la finestra Visualizza la forza e la pressione effettiva (ERTP) corrispondente a questo valore di micrometro. Contemporaneamente, la casella di micrometro lettura diventa attiva.</li>
	<li>Allungare la nave vengano normalizzata ruotando il micrometro in senso antiorario. Immettere il valore di micrometro nella casella lettura micrometro e fare clic sul pulsante Aggiungi punto . Attendere un tempo di ritardo di 60 s nuovamente.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 5.5, continuare ad allungare la nave e aggiungere micrometro valori fino a quando la finestra viene visualizzato il valore di "micrometro X1", che è l'impostazione di micrometro calcolato necessario allungare la nave al suo IC1.</li>
	<li>Impostare il micrometro a X il valore1 . Nota: La tensione normalizzata è in genere 1-2 mN.</li>
</ol>6. arteria contrazione registrazione
Nota: Tutte le soluzioni, tra cui H-T e soluzione High-K+ utilizzati in questa sezione, sono state preparate al punto 2.1.
<ol><li>Dopo la normalizzazione, equilibrare la nave nella camera per 15-20 min. Nota: Questi è alcuna necessità di modificare la soluzione in questo passaggio.</li>
	<li>Sfida la nave con soluzione High-K+ due volte.<ol>
<li>Per sfidare la nave, sostituire soluzione H-T con 5 mL di soluzione di High-K+ per indurre la contrazione per 10 min, seguita da lavaggio con 5 mL di soluzione di H-T 3 - 4 volte. Nota: La tipica contrazione ha una forza massima sopra 3 mN e una forza costante e sostenuta circa 2,5 mN12. Se la prima sfida genera una forza massima sotto 2,5 mN o la forza sostenuta diminuisce con il tempo o la seconda sfida genera una forza molto inferiore rispetto alla dose di prima volta, la nave viene scartata e non essere utilizzata per ulteriori indagini.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sfida la nave con 5 mL di soluzione di High-K+ per indurre la contrazione. Dopo 5 min, aggiungere 0,5 µ l della soluzione di riserva (10 mM in DMSO) neoliensinine14 nella camera per rilassarsi l'imbarcazione ad una concentrazione finale di 1 µM neoliensinine.</li>
	<li>Quando la forza è stabile (solitamente ciò richiede alcuni minuti), aggiungere un altro 0,5 µ l di soluzione di riserva di neoliensinine nella camera per aumentare la concentrazione di 2 µM. aggiungere 1 µ l di soluzione di riserva ogni volta per aumentare la concentrazione di 4, 6, 8 e 10 µM per generare t curva dose-risposta di lui. Nota: Il magazzino e le concentrazioni di lavoro variano tra farmaci.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bevan, J. A., Osher, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+method+for+recording+tension+changes+in+the+wall+of+small+blood+vessels+in+vitro.">A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro.</a> Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).</li><li>Mulvany, M. J., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+situ.">Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ.</a> Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).</li><li>Mulvany, M. J., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+Properties+of+Small+Arterial+Resistance+Vessels+in+Spontaneously+Hypertensive+and+Normotensive+Rats.">Contractile Properties of Small Arterial Resistance Vessels in Spontaneously Hypertensive and Normotensive Rats.</a> Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).</li><li>Mulvany, M. J., Nyborg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+calcium+sensitivity+of+mesenteric+resistance+vessels+in+young+and+adult+spontaneously+hypertensive+rats.">An increased calcium sensitivity of mesenteric resistance vessels in young and adult spontaneously hypertensive rats.</a> British Journal of Pharmacology. 71 (2), 585-596 (1980).</li><li>Mulvany, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Procedures for investigation of small vessels using small vessel myograph. , (2004).</li><li>Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+smooth+muscle+cells+in+the+walls+of+arterial+resistance+vessels.">Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels.</a> The Journal of Physiology. 275, 88-101 (1978).</li><li>Michael, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+blood+pressure+arising+from+a+defect+in+vascular+function.">High blood pressure arising from a defect in vascular function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (18), 6702-6707 (2008).</li><li>Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenteric+artery+contraction+and+relaxation+studies+using+automated+wire+myography.">Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>del Campo, L., Ferrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Wire Myography to Study Vascular Tone and Vascular Structure of Isolated Mouse Arteries. , (2015).</li><li>Fisher, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+phenotypic+diversity+and+function.">Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function.</a> Physiological Genomics. 42 (3), 169-187 (2010).</li><li>Crowley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+the+kidney+and+systemic+tissues+in+blood+pressure+regulation+by+the+renin-angiotensin+system.">Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin-angiotensin system.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (4), 1092-1099 (2005).</li><li>Qiao, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+phosphatase+target+subunit+1+(MYPT1)+regulates+the+contraction+and+relaxation+of+vascular+smooth+muscle+and+maintains+blood+pressure.">Myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1) regulates the contraction and relaxation of vascular smooth muscle and maintains blood pressure.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22512-22523 (2014).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+myosin+light+chain+kinase+in+regulation+of+basal+blood+pressure+and+maintenance+of+salt-induced+hypertension.">Role of myosin light chain kinase in regulation of basal blood pressure and maintenance of salt-induced hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), H584-H591 (2011).</li><li>Yang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+a+tribenzylisoquinoline+alkaloid+from+Nelumbo+nucifera+Gaertn,+a+novel+potential+smooth+muscle+relaxant.">Isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera Gaertn, a novel potential smooth muscle relaxant.</a> Fitoterapia. 124, 58-65 (2018).</li><li>Slez&#225;k, P., Waczul&#237;kov&#225;, I., Bali&#353;, P., P&#250;zserov&#225;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+Normalization+Factor+for+Wire+Myography+of+Rat+Femoral+Artery.">Accurate Normalization Factor for Wire Myography of Rat Femoral Artery.</a> Physiological Research. 59 (6), 1033-1036 (2010).</li><li>Kearney, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+hypertension:+analysis+of+worldwide+data.">Global burden of hypertension: analysis of worldwide data.</a> The Lancet. 365 (9455), 217-223 (2005).</li><li>Good, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+Ion+Buffers+for+Biological+Research.">Hydrogen Ion Buffers for Biological Research.</a> Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'ipertensione è una sfida di sanità pubblica diffusa grazie alle sue complicazioni severe, tra cui cardiovascolari e renali malattie16. Comprensione della patogenesi dell'ipertensione ed esplorare più farmaci anti-ipertensivi è diventato un compito urgente in questo campo. La pressione sanguigna è generata e mantenuta dalla resistenza periferica della circolazione. Secondo legge di Poiseuille, relativamente piccole arterie generano una grande percentuale di resistenza circolatoria e servono ...

Il sistema di myograph piccolo vascello usato qui era per misurare la contrazione isometrica dei vasi di piccola resistenza con diametri interni che vanno da 100 a 400 µm. isolato piccoli vasi (circa 2 mm di lunghezza) sono stati inseriti da due fili di diametro da 40 µm e sono stati quindi montato sulle mascelle micrometro-sul lato e trasduttore in modo sequenziale. Questa tecnica di myograph era in primo luogo suggerita in 19721 e poi sviluppata principalmente da Mulvany e suoi colleghi2,3,4,5,6. Ora è una tecnica matura con attrezzatura stabile, prestazione facile e una normalizzazione standard procedura7,8,9. Abbiamo utilizzato questo metodo con alcune modifiche per misurazioni nell'arteria mesenterica del mouse.
Muscolo liscio vascolare linee le pareti dei vasi sanguigni quasi tutti. La loro funzione fondamentale è quello di generare forze attraverso la contrazione in risposta a vari stimoli. La normale contrattilità del muscolo liscio vascolare è essenziale per la regolazione della pressione arteriosa e nutrizione supplemento10. Regolazione anormale della pressione sanguigna si traduce in una varietà di malattie, compreso ipertensione, infarto e ischemia. Parecchi studi hanno suggerito che anomala della pressione sanguigna è sempre associata a muscolo liscio vascolare disfunzionale contrattilità7,11,12,13. Il metodo myograph consente di indagine di isometrica contrattilità dei vasi del mouse indotto da vari stimoli, tra cui i vasocostrittori, inibitori e farmaci. Misure di successo di contrazione ci aiuterà a comprendere i meccanismi di mantenimento della pressione sanguigna e la patogenesi delle malattie vascolari del muscolo liscio-collegato e di esplorare nuovi approcci terapeutici.
Molte erbe cinesi sono stati ampiamente usate per il trattamento clinico delle malattie vascolari; Tuttavia, la loro efficaci ingredienti solitamente rimangono sconosciuti. Quindi, isolamento e identificazione dei componenti efficaci è molto importante per lo sviluppo di nuovi farmaci. La tecnologia multi-filo myograph offre un approccio semplice per lo screening di componenti attivi in erbe. Abbiamo segnalato diversi studi utilizzando il sistema di myograph dei piccoli vasi per indagare la contrazione dell'arteria mesenterica del mouse e identificato composti naturali con attività anti-ipertensione12,13,14. Qui, descriviamo il dettagliato protocollo per il metodo di myograph e di valutare l'effetto rilassante del neoliensinine isolato dagli embrioni dei semi di loto (Nelumbo nucifera Gaertn.) 14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Multi wire myograph system</td>
			<td>DMT</td>
			<td>610-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel wire</td>
			<td>DMT</td>
			<td>400447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geuder dissection scissor</td>
			<td>DMT</td>
			<td>400431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>DMT</td>
			<td>300413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab/8SP</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>LabChart 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100511-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography

La tecnica di myograph di filo viene utilizzata per valutare la contrattilità della muscolatura liscia vascolare in risposta alla depolarizzazione, GPCR agonisti/inibitori e farmaci. È ampiamente usato in molti studi sulle funzioni fisiologiche del muscolo liscio vascolare, la patogenesi di malattie vascolari quali l'ipertensione e lo sviluppo di farmaci miorilassanti muscolo liscio. Il mouse è un animale di modello ampiamente usato con una grande piscina di modelli di malattia e ceppi geneticamente modificati. Abbiamo introdotto questo metodo per misurare la contrazione isometrica dell'arteria mesenterica del mouse in dettaglio. Un segmento di 1.4 millimetri dell'arteria mesenterica resistenza del mouse è stato isolato e montato su una camera di myograph passando due fili di acciaio attraverso il relativo lumen. Dopo i passaggi di equilibrazione e normalizzazione, il segmento di vaso è stato rafforzato da una soluzione di high-K+ due volte prima del dosaggio di contrazione. Come un esempio dell'applicazione di questo metodo nello sviluppo della droga, abbiamo misurato l'effetto rilassante di una nuova sostanza naturale, neoliensinine, isolata da un'erba cinese, embrioni del seme del loto (Nelumbo nucifera (Gaertn.) mouse mesenterica arterie. I segmenti di nave montati sulla camera di myograph sono stati stimolati con una soluzione di high-K+ . Quando la tensione di forza ha raggiunto una fase stabile e sostenuta, dosi cumulative di neoliensinine sono stati aggiunti alla camera. Abbiamo trovato che neoliensinine aveva un effetto miorilassante dose-dipendente sulla contrazione del muscolo liscio, così suggerendo che esso rechi potenziale attività contro l'ipertensione. Inoltre, come il segmento di nave può sopravvivere almeno 4 ore dopo il montaggio e mantenere la contrattilità indotta dalla soluzione high-K+ per molte volte, ci suggeriscono che il sistema di myograph di filo può essere utilizzato per il lungo processo di screening di stupefacenti.

Abbiamo misurato la contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica del mouse usando un sistema multi-filo myograph ed abbiamo valutato l'effetto rilassante di neoliensinine purificato dagli embrioni dei semi di loto (Nelumbo nucifera Gaertn.) 14. l'arteria mesenterica resistenza del mouse era isolato, pulita dei tessuti connettivi e tagliato in segmenti di 1,4 mm. Il segmento dell'arteria è stato inserito da due fili di acciaio in Ca2 +-lib...

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Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

La tecnica di myograph di filo è utilizzata per studiare le funzioni muscolari lisce e schermo nuove droghe. Segnaliamo un protocollo dettagliato per misurare la contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica del mouse e per lo screening di nuovi farmaci rilassanti di muscolo liscio vascolare.

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

isometric-contractility-measurement-mouse-mesenteric-artery-using

Research

JoVE Journal

Medicine

14.6K Views.  Nanjing University. La tecnica di myograph di filo è utilizzata per studiare le funzioni muscolari lisce e schermo nuove droghe. Segnaliamo un protocollo dettagliato per misurare la contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica del mouse e per lo screening di nuovi farmaci rilassanti di muscolo liscio vascolare.

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Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modello murino di Mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

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The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

L&#39;applicazione di permanente legatura dell&#39;arteria cerebrale media nel mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

Contrazione Arteria mesenterica e Studi Relax Utilizzando Myography automatica Wire

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Epidural Intracranial Pressure Measurement in Rats Using a Fiber-optic Pressure Transducer

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and cardiac arrest. This elevation may result in further neurological injury, in the form of transtentorial herniation1,2,3,4, midbrain compression, neurological deficit or increased cerebral infarct2,4. Current therapies are often inadequate to control elevated ICP in the clinical setting5,6,7 . Thus there is a need for accurate methods of ICP measurement in animal models to further our understanding of the basic mechanisms and to develop new treatments for elevated ICP.
In both the clinical and experimental setting ICP cannot be estimated without direct measurement. Several methods of ICP catheter insertion currently exist. Of these the intraventricular catheter has become the clinical 'gold standard' of ICP measurement in humans8. This method involves the partial removal of skull and the instrumentation of the catheter through brain tissue. Consequently, intraventricular catheters have an infection rate of 6-11%9. For this reason, subdural and epidural cannulations have become the preferred methods in animal models of ischemic injury. 
Various ICP measurement techniques have been adapted for animal models, and of these, fluid-filled telemetry catheters10 and solid state catheters are the most frequently used11,12,13,14,15. The fluid-filled systems are prone to developing air bubbles in the line, resulting in false ICP readings. Solid state probes avoid this problem (Figure 1). An additional problem is fitting catheters under the skull or into the ventricles without causing any brain injury that might alter the experimental outcomes. Therefore, we have developed a method that places an ICP catheter contiguous with the epidural space, but avoids the need to insert it between skull and brain. 
An optic fibre pressure catheter (420LP, SAMBA Sensors, Sweden) was used to measure ICP at the epidural location because the location of the pressure sensor (at the very tip of the catheter) was found to produce a high fidelity ICP signal in this model. There are other manufacturers of similar optic fibre technologies13 that may be used with our methodology. Alternative solid state catheters, which have the pressure sensor located at the side of the catheter tip, would not be appropriate for this model as the signal would be dampened by the presence of the monitoring screw. 
Here, we present a relatively simple and accurate method to measure ICP. This method can be used across a wide range of ICP related animal models.

A novel technique to record the pressures within the skull is described. The minimally invasive method uses a fibre-optic pressure sensing system to accurately measure intracranial pressure (ICP) in anaesthetized rats without causing significant brain trauma. The technique may be used in a wide range of experimental models.

Epidurale Misurazione della pressione intracranica in ratto utilizzando una fibra ottica trasduttore di pressione

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and ...

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

Nella misura in vivo della superficie polmonare strato endoteliale mouse

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Valutare Miogenica risposta e Vasoactivity nelle arterie di resistenza mesenteriche Utilizzando Myography Pressione

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

Isolare e utilizzo Sezioni di mesenterica bovina arteria e vena come un saggio biologico per verificare Vasoactivity nel piccolo intestino

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Measurement of the Pressure-volume Curve in Mouse Lungs

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential phenotypic changes are best assessed by measurement of the changes in lung elasticity. To best understand specific mechanisms underlying such pathologies in mice, it is essential to make functional measurements that can reflect the developing pathology. Although there are many ways to measure elasticity, the classical method is that of the total lung pressure-volume (PV) curve done over the whole range of lung volumes. This measurement has been made on adult lungs from nearly all mammalian species dating back almost 100 years, and such PV curves also played a major role in the discovery and understanding of the function of pulmonary surfactant in fetal lung development. Unfortunately, such total PV curves have not been widely reported in the mouse, despite the fact that they can provide useful information on the macroscopic effects of structural changes in the lung. Although partial PV curves measuring just the changes in lung volume are sometimes reported, without a measure of absolute volume, the nonlinear nature of the total PV curve makes these partial ones very difficult to interpret. In the present study, we describe a standardized way to measure the total PV curve. We have then tested the ability of these curves to detect changes in mouse lung structure in two common lung pathologies, emphysema and fibrosis. Results showed significant changes in several variables consistent with expected structural changes with these pathologies. This measurement of the lung PV curve in mice thus provides a straightforward means to monitor the progression of the pathophysiologic changes over time and the potential effect of therapeutic procedures.

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung&#8217;s structural changes with developing pathology.

Misura della curva di pressione-volume in mouse polmoni

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

Modello murino di dall&#39;arteria femorale Wire Injury con impianto di una Perivascolare Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induzione di aterosclerosi accelerata nei topi: il modello "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...