Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo centriolo, come localizzare le proteine in una regione specifica del centriolo. Il vantaggio principale di queste tecniche che forniamo i mezzi per concentrare il centriolo per ottenerli in più orientamenti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia centriola di Chlamydomonas, può anche essere applicato ad altri sistemi, come centrioli umani isolati e paramecio.
A dimostrare la procedura saranno il dottorando Nikolai Klena, un'altra dottoranda Maeva Le Guennec, e il postdoc nel laboratorio Davide Gambarotto. Per iniziare questa procedura, preparare innanzitutto tutti i media e le impostazioni cultura delle celle C.Reinhardtii come delineato nel protocollo di testo. Trasferire le cellule preparate in tubi conici da 50 millilitri e centrifugarle a 600 volte g per 10 minuti.
Lavare il pellet una volta con 50 millilitri di 1x PBS e ruotare nuovamente le cellule a 600 volte g per 10 minuti. Utilizzare una pipetta per rimorsi il pellet in 100 millilitri di tampone di deflagellazione a temperatura ambiente. Posizionare il becher su un agitatore magnetico e aggiungere lentamente 0,5 acido acetico molare ad un pH finale da 4,5 a 4,7.
Lasciare incubare questa miscela a temperatura ambiente per due minuti. Dopo questo aggiungere lentamente gocce di un normale idrossido di potassio per ripristinare il pH a 7,0, trasferire le cellule in tubi da 50 millilitri e centrifugarle a 600 volte g per 10 minuti, per rimuovere eventuali flagelli staccati. Scartare il supernatante e conservare il pellet sul ghiaccio fino a quando non è pronto per il lavaggio.
Quando è pronto, lavare il pellet due volte utilizzando 50 millilitri di 1x PBS a quattro gradi Celsius per lavaggio. Ruotare il pellet lavato a 600 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Resuspend il pellet in 30 millilitri di 1x PBS.
Quindi, caricare lentamente la sospensione su un cuscino da 20 millilitri del 25% di saccarosio, senza miscelazione. Ruotare a 600 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti per rimuovere la flagella rimanente e diffondere le cellule nel saccarosio. Utilizzando un aspiratore, aspirare con cura il supernatante mantenendo solo i 20 millilitri più in basso.
Lavare il saccarosio rimanente aggiungendo 20 millilitri di PBS freddo 1x. Centrifuga a 600 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Resuspend il pellet in 10 millilitri di 1x PBS a quattro gradi Celsius, assicurandosi che non ci siano grumi nella soluzione.
Trasferire il pellet rimescolato in una nuova bottiglia da 250 millilitri, aggiungere il tampone di lisi, integrato con 5.000 unità di DNasi, alla bottiglia contenente le celle. Incubare a quattro gradi Celsius per un'ora, mescolando ogni 15 minuti invertendo accuratamente la bottiglia. Trasferire le cellule liti in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare a 600 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Utilizzando una pipetta, raccogliere il supernatante e caricarlo in un tubo a fondo rotondo da 30 millilitri su ghiaccio contenente due millilitri di cuscino di saccarosio al 60%. Centrifuga questo a 10.000 volte g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, aspirare il supernatante fino a un millilitro sopra il cuscino di saccarosio.
Si noti l'interfaccia gialla tra l'un millilitro del supernatante rimanente e i due millilitri di cuscino di saccarosio. Utilizzando una punta P1000 tagliata, mescolare delicatamente il supernatante rimanente con il saccarosio. Mettere in comune tutti i cuscini di saccarosio e conservarli sul ghiaccio.
Preparare quindi un gradiente di saccarosio dal 40% al 70% in un tubo di polipropilene a parete sottile da 38,5 millilitri, come indicato nel protocollo di testo. Caricare lentamente le interfacce in pool nella sfumatura. Bilanciare i tubi con il tampone K-PIPES da 10 millimolari e centrifugare a 68, 320 volte g e quattro gradi Celsius per 75 minuti.
Dopo questo, utilizzare un ago di 0,8 millimetri per fare un foro nella parte inferiore del tubo, assicurandosi di non disturbare i diversi strati di saccarosio. Utilizzare questo foro per raccogliere 12 frazioni di microliter a quattro gradi Celsius. Utilizzando una punta P200 tagliata, preparare un'aliquota aggiuntiva di 10 microliter per ogni frazione da utilizzare durante l'immunofluorescenza.
Quindi, congelare le frazioni in azoto liquido. Per iniziare, posizionare un coverslip sterile di 12 millimetri sull'estremità inferiore incassata del concentratore, assicurandosi di mantenere il lato rivestito di PDL verso il basso. Posizionare l'adattatore direttamente sopra, per limitare il copripasto.
Quindi, invertire il tubo di fondo rotondo e posizionarlo sopra il concentratore, il coverslip e l'adattatore. Usando le pinzette, spingere delicatamente l'insieme fino a raggiungere il fondo del tubo, quindi invertire il tubo. Aggiungere 10 millimolare di tampone K-PIPES fino a raggiungere la parte superiore del concentratore.
Assicurarsi che non vi siano bolle nel cilindro centrale del concentratore. Aggiungere delicatamente 100 microlitri di tampone K-PIPES da 10 millimolare a una delle aliquote della frazione centriolare arricchita e mescolare accuratamente utilizzando una pipetta P200. Successivamente, rimuovere 100 microlitri di tampone K-PIPES dal centro cavo del concentratore e aggiungere 100 microlitri della miscela di frazione tampone, assicurandosi che il contenuto rimanga al centro cavo del concentratore.
Gira a 10.000 volte g per 10 minuti in una centrifuga che viene pre-raffreddata a quattro gradi Celsius. Successivamente, utilizzare una pinzetta per rimuovere il concentratore. Inserire un dispositivo agganciato a mano nel foro presente nel bordo fessurato dell'adattatore e sollevare delicatamente per recuperare il copripavo.
Una volta raggiunta la parte superiore del tubo, utilizzare un dito guantato per intrappolare il bordo dell'adattatore e utilizzare una pinzetta per rimuovere il coverslip, tenendo presente quale lato del copripacchi contiene centriole. Quindi, eseguire la fissazione e la colorazione dell'immunofluorescenza dei centrioli concentrati. Per iniziare, incubare i copricapo con i centrioli nella scatola del laboratorio di trasmissione in polistirolo cristallino preparata riempita con metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius per 5 minuti.
Utilizzando una pinzetta, trasferire le coverlips in una scatola di laboratorio trasparente riempita con 50 millilitri di 1x PBS. Lasciare lavare le diapositive nel PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, pipettare 60 microlitri di anticorpi primari si mescolano su un pezzo di involucro di tenuta di laboratorio in una camera umidificata.
Posare con cura i copripavimenti sopra la miscela di anticorpi con i centrioli direttamente rivolti verso la goccia. Lasciare incubare i copripasci per 45 minuti. Successivamente, rimuovere i copripavimenti e lavarli in una scatola contenente PBS per cinque minuti.
Incubare i copripavimenti lavati per 45 minuti, con anticorpi secondari in PBS 1%BSA e 0,05%Tween-20. Rimuovere i copripavimenti e lavarli per cinque minuti in una scatola contenente PBS. Utilizzando un normale mezzo di montaggio anti-dissolvenza, montare il coverslip su uno scivolo.
Quindi, immagini i centrioli isolati su un microscopio confocale con un obiettivo di olio 63X con un N.A. di 1,4, mentre applichi la deconvoluzione. Impostare la posizione superiore e inferiore della pila Z sopra e sotto il segnale centriolo, rispettivamente, e acquisire una grande pila di immagini che comprende il segnale centriolo totale. Proiettare lo stack ed eseguire una media a particella singola come descritto nel protocollo di testo.
L'immunofluorescenza rappresentativa rivela che sei frazioni sono arricchite per centriole isolate, con un picco per la frazione numero tre, mentre le ultime due frazioni non lo sono, indicando che la purificazione ha successo. Solo circa 30 centriole sono viste per campo visivo senza il concentratore, mentre 183 sono viste con il concentratore. Ciò dimostra che il passaggio concentratore ha successo e consente un arricchimento di sei volte dei centrioli in una regione definita, semplificandone il rilevamento e l'immagine.
La microscopia a super risoluzione viene quindi utilizzata per l'immagine di centrioli macchiati per tubulina monoglutamilata e il software viene utilizzato per generare una media quasi perfetta per ogni orientamento scelto. Dopo cinque iterazioni, sono state generate due classi di medie di centriole monoglutamilate: una vista dall'alto da 63 oggetti e una vista laterale da 98 particelle. La lunghezza della media della classe di vista laterale è di 260 nanometri con un diametro di 250 nanometri, paragonabile al segnale di tubulina monoglutamilato misurato che si vede localizzare all'interno del nucleo del centriolo.
Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere il centriolo isolato sul ghiaccio e congelarlo dopo l'isolamento. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la microscopia crioeletnica e la spettrometria di massa al fine di rispondere a ulteriori domande, come l'architettura nativa del centriolo o la composizione proteica centriola.
