Questo metodo può generare rapidamente immagini ad alta risoluzione che consentono un'analisi della distribuzione spaziale e la quantificazione dei segnali fluorescenti all'interno delle cellule, consentendo al contempo una rapida analisi di più campioni. Le cellule vengono misurate utilizzando l'avanzato sistema di citometria a flusso di imaging, che combina velocità, sensibilità e immagini dettagliate di singole cellule con informazioni spaziali che producono dati unici che non possono essere forniti dall'optometria o dalla microscopia a flusso. Un consiglio importante è quello di fornire abbastanza celle per stabilire le impostazioni dello strumento e sospendiamo le celle ad alta densità per le misurazioni.
A parte questo, l'acquisizione dei dati è semplice e simile alla citometria a flusso convenzionale. Per prima cosa generare le linee cellulari DLBCL come descritto nel manoscritto. Quindi aggiungere una soluzione di EdU da 10 millimolari in un rapporto di uno a 1000 nella coltura cellulare DLBCL e incubare la piastra in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per tre ore dopo aver miscelato la piastra con un leggero dondolio.
Estrarre la piastra dopo l'incubazione e aggiungere una soluzione di clorochina da 100 millimolari ad una concentrazione finale di 75 micromolari. Mescolare dondolando delicatamente e incubare per 30 minuti. Quindi aggiungere 20 millimolari di soluzioni di C12 FDG ad una concentrazione finale di 20 micromolari.
Dopo una delicata miscelazione, incubare la piastra per un'ora come dimostrato in precedenza. Quindi, aggiungere 100 millimolari di soluzione di 2-feniletil-beta-d-tiogalattoside da uno a 50 per interrompere la colorazione FSA beta-gal. E ruotare delicatamente il piatto per mescolare.
Trasferire le cellule in provette sterili da centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 100 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Una volta scartato il surnatante lavare le cellule con quattro millilitri di PBS e centrifugare a 100 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi risospendere i pellet cellulari in 500 microlitri al 4% di soluzione di fissazione della paraformaldeide.
Dopo 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare a 250 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e lavare le cellule con quattro millilitri di PBS due volte e centrifugare a 100 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone di permeabilizzazione della saponina.
Ora trasferire la sospensione in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Pellettare le celle a 250 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi risospendere le cellule in 200 microlitri di soluzione anticorpale primaria e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte, al buio.
Centrifugare i tubi a 250 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e lavare con 100 microlitri di soluzione di lavaggio con saponina. Dopo aver lavato le cellule due volte, scartare il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 500 microlitri di cocktail di rilevamento EdU.
Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio e centrifugare a 250 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e lavare con un millilitro di soluzione di lavaggio alla saponina. Ripetere il lavaggio due volte, scartare il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 20-50 microlitri di PBS.
Prima di accendere lo strumento, svuotare la bottiglia del liquido di scarto e controllare i livelli di SpeedBeads, sterilizzatore, detergente, debubbler e guaina liquidi sufficienti. Dopo aver acceso lo strumento e il software di imaging, fare clic sul pulsante di avvio per inizializzare la fluidica e la calibrazione del sistema. Impostare l'ingrandimento su 40 volte e impostare la velocità fluidica su bassa.
Dopo aver acceso i laser, accendere un laser a 405 nanometri per misurare EdU Pacific Blue, 488 nanometri per misurare C12-FDG e 642 nanometri per misurare Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Impostate il canale sei per il canale di dispersione, il canale uno e il canale nove per il campo luminoso. Quindi iniziare con il campione che dovrebbe avere la massima fluorescenza per impostare l'intensità dei laser e capovolgere delicatamente la provetta per miscelare.
Dopo aver aperto il coperchio del tubo, inserire la provetta sul dock. Fare clic su Carica per avviare e aprire un grafico a dispersione. Quindi, selezionate l'area Caratteristiche, sottolineate MO1 e proporzioni sottolineate MO1 rispettivamente per gli assi X e Y.
Impostare un gate sopra le proporzioni di 0,5 per escludere doppietti e aggregati di celle sotto e sul lato destro e la popolazione SpeedBead sul lato sinistro. Ora aprite Grafico istogramma (Histogram Plot) e selezionate il quadrato medio della radice sfumata della maschera uno e del canale uno per l'asse X. Scegli la popolazione di singoletto e imposta il gate per selezionare le celle focalizzate.
Aprite un grafico a istogramma e selezionate le intensità massime dei pixel non elaborate per i canali due, sette e 11 dell'asse X. Quindi regolare le potenze laser di laser a 488 nanometri, 405 nanometri e laser a 642 nanometri per il canale due, sette e 11 rispettivamente in modo che ogni fluorocromo abbia un valore massimo di pixel grezzo tra 100 e 4.000 per evitare la sovrasaturazione. Scegli la popolazione focalizzata da registrare e fai clic su Acquisisci per misurare i campioni DLBCL con impostazioni coerenti.
Quando si cambiano i campioni per la misurazione, fare clic su Invio per recuperare la provetta del campione. Premere Carica per eliminare il campione. Dopo aver misurato tutti i campioni, spegnere il laser a campo chiaro e a dispersione.
Misurare campioni di controllo di un singolo colore per generare una matrice di compensazione. Fare clic su Shutdown (Arresta) per chiudere il sistema di imaging. Analizza i dati nel software di analisi delle immagini.
Utilizzare lo strumento Spot Wizard del software di analisi delle immagini per contare e quantificare automaticamente i focolai di H2AX gamma nucleare e le immagini di cellule vive. Selezionare due popolazioni di cellule, una con alto e una con basso numero di spot per addestrare la Procedura guidata Spot per un'ulteriore analisi automatica del conteggio degli spot. Il metodo di citometria a flusso nelle immagini a singola cellula ha mostrato un aumento della popolazione C12-FDG positiva, EdU negativa, gamma H2AX positiva, senesced e KARPAS422.
Cellule WSU-DLCL2 e OCI-LY1, ma non nelle cellule SU-DHL6. L'analisi basata sull'imaging ha presentato un numero significativamente più elevato di focolai gamma H2AX e KARPAS422, WSU-DLCL2 e OCI-LY1, ma non nelle cellule SU-DHL6. Risultati simili sono stati rappresentati da dati di frequenza e quantificazione.
L'aggiunta di saponina alla sospensione cellulare è fondamentale, altrimenti gli anticorpi non possono raggiungere gli antigeni interni della cellula e detergenti aggressivi portano alla perdita del segnale C12-FTG La citometria di imaging è ottimale per analizzare i cambiamenti nella localizzazione dei marcatori come la traslocazione di un fattore di trascrizione al nucleo in risposta a determinati stimoli. Tale analisi può essere ottenuta anche con il nostro protocollo. Questo metodo consente la visualizzazione di più marcatori fluorescenti a livello di singola cella che aiuta a rilevare la presenza, l'intensità e la localizzazione dei singoli segnali.
