Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.

1. preparazione delle celle
<ol><li>Piastra di 20.000 celle in 2 mL di terreno di coltura in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti utilizzando una tecnica sterile in una cappa di biosicurezza.</li>
	<li>Posizionare piastre da 6 pozzetti in un incubatore (37 ° C, 5% CO2) per 24 h permettere alle cellule di aderire alle piastre.</li>
</ol>2. preparazione del fotosensibilizzatore per il trattamento delle cellule
<ol><li>Preparare soluzioni di 5-ALA di 0,5, 1 e 2 mM in terreno di coltura. Se il siero bovino fetale (FBS) è un ingrediente del terreno di coltura, preparare e curare le cellule con 5-ALA in soluzione di mezzo di coltura con 0,1% FBS per le incubazioni. 11 , 12 In questo caso, SCC-13 celle non richiedono FBS, quindi 5-ALA è stato aggiunto direttamente al medium privo di siero del keratinocyte completato con bovina estratto pituitario ed il fattore di crescita epidermico.</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con almeno 2 mL di tampone fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Aspirare la PBS e aggiungere 2 mL di 0, 0,5, 1 o 2 mM soluzioni di 5-ALA in pozzi o piastre separate.</li>
	<li>Incubare le cellule con 0, 0,5, 1 o 2 mM 5-ALA su un 36 a 37 ° C Riscaldamento blocco per 30 min. proteggere le cellule da esposizione alla luce durante l'incubazione con foglio di alluminio.</li>
	<li>Le soluzioni di 5-ALA 0, 0,5, 1 e 2 mM di aspirare e lavare le cellule con 2 mL di PBS.</li>
	<li>Aspirare la PBS e aggiungere 2 mL di terreno di coltura per irradiazione di luce blu.</li>
</ol>3. blue Light fototerapia
<ol><li>Prima irradiando le cellule, accendere il dispositivo luminoso blu (ad es., diodi emettitori di luce, fluorescente o alogena) ed eseguire per un ciclo (1.000 s) per riscaldare il dispositivo. Il dispositivo luminoso blu dovrebbe avere una lunghezza d'onda di uscita di 417 + /-5 nm. Consentendo al dispositivo di eseguire per un ciclo prima di trattamenti assicura che la lunghezza d'onda di luce blu e irradianza sono coerenti in tutta la fase di fotoattivazione.</li>
	<li>Utilizzare un fotometro per misurare la radiazione alla superficie delle cellule. L'irraggiamento di luce blu alla superficie delle cellule dovrebbe essere di 10 mW/cm2. La distanza tra la luce e le celle potrebbe essere necessario regolare per ottenere un'irradiazione di 10 mW/cm2 a seconda dell'intensità della sorgente luminosa.</li>
	<li>Posizionare i gruppi di trattamento di ALA 0, 0,5, 1 e 2 mM su una superficie nera sotto la sorgente di luce blu. Irradiare le cellule con luce blu per 1.000 s (16 min e 40 s) per un totale fluence di 10 J/cm2. A seguito di fotoattivazione di luce blu, le cellule sono pronte per l'analisi.</li>
</ol>4. raccolta e colorazione
<ol><li>Preparare il tampone di flusso secondo le linee guida del produttore (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con 2 mL di PBS.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA 0.25% e permettono alle cellule di staccare per circa 3-5 min. Le cellule possono essere esaminate al microscopio per confermare il distacco delle cellule.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di terreno di coltura (o PBS) con 10% siero bovino fetale per disattivare la tripsina.</li>
	<li>Raccolta di sospensione cellulare in tubi di flusso con etichetta 5ml.</li>
	<li>Rotazione tubo di flusso 5ml in una centrifuga a 201 x g per 5 min, aspirato soluzione senza rimuovere il pellet cellulare.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di tampone di flusso con anticorpo coniugato Annessina-V (1 µ l di annessina-v a 39 µ l di tampone di flusso) per ogni campione.</li>
	<li>Risospendere le cellule e collocare nell'incubatrice (37 ° C, 5% CO2) per 20 minuti consentire il legame di annessina-V.</li>
	<li>Aggiungere 3 µ l di 7-AAD a ciascun campione. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. l'analisi citofluorimetrica
<ol><li>Attenersi alle linee guida del produttore di citometro a flusso per set-up (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Raccogliere e analizzare campioni con citometria a flusso. 13
</li>
	<li>Eseguire un confronto statistico di trattamento ed i gruppi di controllo mediante analisi della varianza (ANOVA)14. Confrontare i mezzi per i gruppi di trattamento per la media del controllo con test di Dunnett, una per l'analisi post hoc .</li>
</ol>

<ol>
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DUSA/sole farmaceutici forniti 5-ALA e il dispositivo luminoso BLU-U. Questo manoscritto è stato sostenuto dal residuo di Dr. Jagdeo finanziamenti. I contenuti non rappresentano le opinioni di l'US Department of Veterans Affairs o di governo degli Stati Uniti.

C'era un importante crescita in apoptosi SCC-13 dopo 30 min incubazioni di 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA seguita da 1.000 s di luce blu. Questi risultati sono coerenti con la nostra ricerca precedentemente pubblicato che dimostrano che le incubazioni di 5-ALA di 30 min seguita da attivazione luce blu porta ad un aumento dose-dipendente della percentuale delle cellule del fibroblasto che subiscono apoptosi12, 14.
Questo approccio sperimentale per studiare PDT presenta vantaggi e limitazioni. I metodi descritti sono conformi alla pratica clinica come un PS commercialmente disponibile e fonte di luce sono stati usati. I ricercatori possono personalizzare i metodi con diversi tipi di cellule, PSs, fonti di luce e parametri di irradiazione. Tuttavia, ci sono limitazioni di questo approccio come questo protocollo è progettato per coltivate in un monostrato di cellule aderenti. Nella pratica clinica, le differenze in architettura o malattia patologia del tessuto (cioè, ipercheratosi o fibrosi) possono ridurre assorbimento di PS o penetrazione15di luce. Di conseguenza, le dosi di trattamento ed i risultati sperimentali non possono direttamente corrispondono alla pratica clinica. Modelli di tumore sferoide e chip microfluidico sono stati studiati come metodi per replicare più strettamente tumore microambienti16,17,18. Sferoidi hanno nicchie cellulare interni ed esterni che differenzialmente potrebbero incorporare i fotosensibilizzanti e rappresentano l'architettura di tumore eterogeneo. Altri ricercatori hanno utilizzato chip microfluidici per condizioni di trattamento dello schermo e consegna vascolare di fotosensibilizzatori. Tuttavia, chip microfluidici può essere costoso per sviluppare o difficili da implementare per i ricercatori non hanno familiari con la tecnica. Inoltre, sferoidi e chip microfluidici potrebbero non riflettere il trattamento clinico dei tumori della pelle in cui fotosensibilizzanti sono applicati direttamente alla superficie del tumore senza diffusione vascolare. I ricercatori potrebbero essere necessario valutare i pro e i contro della cultura dello strato monomolecolare, modelli del tumore sferoide e chip microfluidici per studiare PDT in sistemi differenti di malattia. Come non esistono cellule immunitarie o matrice extracellulare, non è possibile determinare come PDT colpisce interazioni cellula-cellula complessa. I ricercatori potrebbero essere necessario confermare in vitro risultati sperimentali utilizzando modelli animali e studi clinici. Per raggiungere alta validità Inter-test, è importante mantenere coerente incubazione e parametri di luce, durante gli esperimenti in vitro PDT.
Temperatura è noti per alterare l'efficacia della PDT19. Uno studio ha dimostrato che la morte delle cellule, l'assorbimento di 5-ALA, PP-IX formazione e rilascio di citochine possono essere migliorate incubando le cellule con 5-ALA a temperature fino a 44 ° C19. Temperature di incubazione superiori a 44 ° C possono portare alla morte cellulare indotta termici e temperature di incubazione inferiore a 20 ° C non possono portare a significativo 5-ALA assorbimento e accumulo19. Si consiglia di ricercatori eseguano le incubazioni PS su un blocco di temperatura regolabile riscaldamento ad una temperatura costante di controllo per la confusione potenzialmente effetti termici. Inoltre, è importante Incubare il fotosensibilizzatore per una quantità sufficiente di tempo per consentire la conversione di 5-ALA in PP-IX. In questo protocollo, SCC-13 cellule sono state incubate con 5-ALA per 30 min, che con successo ha indotto apoptosi delle cellule. Precedentemente abbiamo dimostrato che una 10 min di incubazione di 5-ALA non ha significativamente aumentato gli apoptosi nei fibroblasti rispetto al controllo non trattato fibroblasti11,14. PP-IX inizia ad accumulare nella pelle del topo dopo incubazione di 5-ALA per sei minuti a 37 ° C. Pertanto, dopo dieci minuti di incubazione di 5-ALA, potrebbe non esserci sufficiente accumulo di PP-IX per indurre apoptosi di cellule20. Si consiglia un periodo di incubazione minimo di 20 a 30 min per 5-ALA basato su nostri precedenti studi11,14. I ricercatori potrebbero essere necessario ottimizzare il periodo di incubazione basato sul laboratorio impostazione, fotosensibilizzatore di interesse, tipo di cella e indicazione clinica. Esperimenti di titolazione e ottimizzazione dell'anticorpo possono essere eseguiti per ottenere i migliori risultati utilizzando le linee guida del produttore. Altri saggi di interesse possono essere eseguite seguendo la fotoattivazione di luce blu tra cui diidroetidio Quantificazione cytometric di flusso del ROS. 14
Variazione della quantità di luce trasportato per unità di superficie (cioè, irraggiamento) e dose di irradiazione totale (cioè, fluence) durante la fase di fotoattivazione può influenzare la formazione di ROS e di apoptosi delle cellule21. Il rapporto tra fluenza, irradianza e ora può essere descritto dalla seguente equazione:
Fluenza (J/cm2) = irraggiamento (W/cm2) x tempo (s)
Come fluence dipende dal tempo, accorciando o allungando le fasi di fotoattivazione cambiano l'efficacia del trattamento. L'irraggiamento è proporzionale alla distanza al quadrato tra la sorgente luminosa e il tessuto bersaglio. Di conseguenza, se la luce è troppo lontano, potrebbe non esserci sufficiente energia luminosa consegnato al tessuto mirato per eccitare la PS. in alternativa, l'irraggiamento può essere aumentata di luce che si riflette le superfici circostanti. Pertanto, si consiglia di eseguire irradiazioni di luce con le piastre per colture cellulari collocate su una superficie nera per impedire la riflessione della luce. I ricercatori possono acquisire commercialmente disponibili o approvato dalla FDA blu light - emitting diode e fluorescente dispositivi da utilizzare in esperimenti di PDT, ma questi dispositivi possono avere diverse potenze e uniformità di campo chiaro. Un fotometro di lunghezza d'onda specifica dovrebbe essere utilizzato per misurare l'irraggiamento presso la superficie delle cellule e l'uniformità del campo chiaro prima di ogni esperimento per ottenere risultati coerenti. Un diffusore disponibile in commercio può essere utilizzato per migliorare l'uniformità di campo, se necessario.
In sintesi, abbiamo descritto un approccio in vitro ad indagare PDT da dettagli teoria, metodi sperimentali, limitazioni, potenziali insidie e consigli per l'ottimizzazione. PDT è che un'utile ricerca clinica di routine e in vitro può consentire lo sviluppo di romanzo PSs, ottimizzazione di protocolli e nuove indicazioni per PDT.

Terapia fotodinamica (PDT) è una procedura medica che coinvolge l'incubazione di un fotosensibilizzatore esogenicamente applicata (PS) seguita da luce visibile fotoattivazione di indurre apoptosi delle cellule. La Federal Drug Administration (FDA) ha approvato PDT per il trattamento delle cheratosi attiniche (AK), e le linee guida cliniche consigliano PDT come trattamento per alcuni tumori della pelle non melanoma e acne vulgaris1,2. Usi non-dermatologiche emergenti per PDT includono trattamento di cancri gastrointestinali, della prostata e ginecologici3. PDT è una modalità terapeutica vantaggiosa in quanto è basso costo, non invasivo e associate a eventi avversi minimi e cicatrici2.
Nel primo passaggio della PDT, un PS è applicato e accumulo intracellulare2. Negli Stati Uniti, acido 5-aminolevulinico topico (5-ALA) è comunemente usato per trattare AKs. Durante l'incubazione fase, 5-ALA viene convertita in protoporfirina IX (PP-IX) via la via di biosintesi del heme in cellule costituite3. Le cellule di cancro e pre-cancro sono diminuiti ferrochelatase attività, che converte la protoporfirina IX (PP-IX), il prodotto finale, EME. Di conseguenza, le cellule di cancri si accumulano PP-IX rispetto a cellule normali4,5. Questo accumulo di PP-IX in cancro e cellule pre-tumorali rispetto al tessuto circostante permette di PDT essere un approccio mirato con minimi effetti avversi. Irradiazione di luce porta alla generazione di specie (ROS) dell'ossigeno reattivo quando ossigeno accetta elettroni eccitati da PP-IX. PP-IX ha un assorbimento di picco nello spettro ultravioletto con cime più piccole tutto lo spettro di luce visibile, tra cui blu e rosso luce2. Formazione di ROS può infine condurre ad apoptosi delle cellule, rottura della membrana, danno mitocondriale, modulazione immune, proliferazione dei cheratinociti e collagene fatturato6,7,8,9 , 10.
PDT è stato sviluppato nel 1970 ed è una modalità terapeutica in evoluzione3. Il protocollo approvato dalla FDA per il trattamento di AKs consiglia di incubazione di 5-ALA pelle per 14 – 18 h, ma le incubazioni 1 o 2 h sono comunemente utilizzate nella pratica clinica2. In vitro, abbiamo dimostrato che più breve 15 min incubazioni di 5-ALA possono aumentare apoptosi delle cellule del fibroblasto rispetto ai fibroblasti non trattati11,12. Inoltre, romanzo chlorin, ftalocianina e basata su nanoparticelle PSs stanno studiandi per migliorare efficacia di PDT3. Qui, presentiamo un metodo in vitro per studiare PDT in un carcinoma di cellule squamous aderente celle. In questo protocollo, SCC-13 le cellule vengono incubate con 0, 0.5, 1.0 e 2 mM 5-ALA per 30 min e fotoattivazione con 417 nm blu luce per 1.000 s. La misura primaria di risultato è apoptosi e necrosi, come misurato tramite Annessina-V e 7-aminoactinomycin D (7-AAD) flusso cytometry. Questo tipo di terapia è progettato per simulare PDT e può essere regolato a studiare l'uso della PDT con altre linee cellulari, fotosensibilizzanti, temperature d'incubazione o fotoattivazione lunghezze d'onda. Preparazione dei gruppi di controllo aggiuntive può essere necessarie, tra cui non macchia, unico fluoroforo macchiato, controlli positivi e negativi per citometria a flusso. Una rassegna completa della teoria, protocolli, disegno sperimentale e gating per apoptosi/necrosi flusso cytometry può essere trovata altrove13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1259">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Keratinocyte serum free medium&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:204px;">17005042</td>
			<td style="width:623px;">Culture medium for SSC-13 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM low glucose glutamax</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10567022</td>
			<td>Possible culture medium for other cell types</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">6-well culture plates</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting and plating&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BLU-U light&#160;</td>
			<td>DUSA</td>
			<td>Request from manufacturer</td>
			<td>Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-ALA</td>
			<td>DUSA</td>
			<td>Request from manufacturer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>C17032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowCellect Annexin Red Kit</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>FCCH100108&#160;</td>
			<td>Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSCanto II</td>
			<td>BD</td>
			<td>Request from manufacturer</td>
			<td>Any flow cytometer may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Counting Chamber</td>
			<td>Hausser</td>
			<td>3120</td>
			<td>For cell counting and plating&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Request from manufacturer</td>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to photodynamic therapy

Terapia fotodinamica (PDT) è una procedura medica che coinvolge l'incubazione di un fotosensibilizzatore esogenicamente applicata (PS) seguita da luce visibile fotoattivazione di indurre apoptosi delle cellule. La Federal Drug Administration ha approvato PDT per il trattamento della cheratosi attinica, e le linee guida cliniche consigliano PDT come trattamento per alcuni tumori della pelle non melanoma e acne vulgaris. PDT è una modalità terapeutica vantaggiosa come è basso costo, non invasivo e associato con eventi avversi minimi e spaventare. Nel primo passaggio della PDT, un PS è applicato e accumulo intracellulare. Irradiazione di luce successiva induce la formazione di specie reattive dell'ossigeno, che può infine condurre ad apoptosi delle cellule, rottura della membrana, danno mitocondriale, modulazione immune, proliferazione dei cheratinociti e fatturato di collagene. Qui, presentiamo un metodo in vitro per studiare PDT in una linea cellulare aderente. Questo tipo di terapia è progettato per simulare PDT e può essere regolato a studiare l'uso della PDT con varie linee cellulari, fotosensibilizzanti, temperature d'incubazione o fotoattivazione lunghezze d'onda. Carcinoma a cellule squamose cellule sono stato incubato con 0, 0.5, 1.0 e 2 mM l'acido 5-aminolevulinico (5-ALA) per 30 min e fotoattivazione con 417 nm blu luce per 1.000 s. La misura primaria di risultato era apoptosi e necrosi, come misurato tramite Annessina-V e 7-aminoactinomycin D flusso cytometry. C'era un aumento dose-dipendente in apoptosi dopo trenta minuti incubazione di 5-ALA. Per raggiungere alta validità Inter-test, è importante mantenere coerente incubazione e parametri di luce, durante gli esperimenti in vitro PDT. PDT è che un'utile ricerca clinica di routine e in vitro può consentire lo sviluppo di romanzo PSs, ottimizzazione di protocolli e nuove indicazioni per PDT.

Dopo SCC-13 le cellule sono state incubate per 30 min con 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA e irradiate con 1.000 s di luce blu, c'era un aumento dose-dipendente nell'apoptosi delle cellule. Apoptosis totale (media ± errore standard della media) era 3.94 ± 0.34, 7,90 ± 0,52, 23.86 ± 0,52 e ± 38.33 1,81 dopo 30 min di incubazione con 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA, rispettivamente e 1000 secondi di blu chiaro (Figura 1). Abbiamo confrontato la percentuale media di apoptotic delle cellule tra 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA incubate gruppi mediante ANOVA. Le cellule trattate con 1 e 2 mM 5-ALA ha avuto un aumento significativo nell'apoptosi delle cellule rispetto a 0 mM 5-ALA cellule trattate. La Figura 2A Mostra rappresentativa flusso cytometric gating di forward scatter (FSC) contro dispersione laterale (SSC) per SCC-13 cellule incubate con 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA. Il gating cerchio racchiude la popolazione delle cellule di SCC-13. Per questo esperimento, 7500 eventi sono stati raccolti e il cancello di popolazione cellulare SCC-13 catturato almeno il 90% degli eventi. Figura 2B illustra un rappresentanza terreno di 7-AAD sull'asse x e Annessina-V sull'asse y. Le popolazioni delle cellule sono gated in quattro quadranti (Q1 a Q4) di discriminare le cellule apoptotiche. Q1 in fase precoce apoptosi di cellule (alta annessina-v, basso 7-AAD) rappresenta. Cellule di Q2 (alta annessina-v, alta 7-AAD) rappresentano in fase tardiva apoptosi o necrosi. Cellule di Q3 (basso annessina-v, alta 7-AAD) rappresenta in fase di necrosi. Rappresenta (basso annessina-v, basso 7-AAD) Q4 cellule non subire apoptosi o necrosi. Per calcolare la percentuale delle cellule che subiscono gli apoptosi, abbiamo aggiunto la percentuale delle cellule in Q1 e Q2. Incoerenza nella lunghezza di periodo di incubazione di 5-ALA, temperatura di incubazione o dose di irradiazione di fotoattivazione può alterare l'efficacia della PDT. Figura 3 viene illustrato un complotto di cytometric flusso Annessina-V e 7-AAD rappresentanza quando varia la temperatura di incubazione (cioè, 27, 36 o 42 ° C). C'era un aumento di temperatura dipendente in apoptosi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig1.jpg"> Figura 1: aumento Dose-dipendente in apoptosi dopo trenta minuti di incubazione di 5-ala 5-ALA incubato a 36 ° C per trenta minuti seguiti da 1.000 s di luce blu in cellule SCC-13. Barre rappresentano la media delle percentuali Annessina-V cellule positive in ogni trattamento e gruppo di controllo. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia tecnica. Significatività statistica è stata determinata mediante ANOVA, con p < 0,05 contrassegnati da un asterisco (*). Barre di errore rappresentano la media ± errore standard della media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig2.jpg"> Figura 2: rappresentante flusso Cytometry trame. (A) rappresentante forward scatter vs lato grafici a dispersione cytometry in unità arbitrarie (AU) per x - e asse y per le cellule incubate 5-ALA di 0, 0,5, 1 e 2 mM. Per questo esperimento, 7500 eventi sono stati raccolti e catturato il cancello di popolazione cellulare SCC-13 90% degli eventi. (B) rappresentante Annessina-V vs 7-AAD flusso cytometry terreni a AU per x - e asse y per le cellule incubate 5-ALA di 0, 0,5, 1 e 2 mM. Q1: prime cellule apoptotiche, Q2: tarda cellule apoptotiche/necrotiche, Q3: cellule necrotiche e Q4: cellule vitali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig3.jpg"> Figura 3: 5-ALA a diverse temperature di incubazione possono alterare l'efficacia della PDT. Citometria a flusso nel rappresentante Annessina-V vs 7-AAD terreni a AU per x - e asse y per SCC-13 cellule incubate con 0.5 mM 5-ALA al 27, 36 e 42 ° C. Q1: prime cellule apoptotiche, Q2: tarda cellule apoptotiche/necrotiche, Q3: cellule necrotiche e Q4: cellule vitali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Terapia fotodinamica (PDT) è una procedura medica che coinvolge l'incubazione di un fotosensibilizzatore esogenicamente applicata (PS) seguita dalla fotoattivazione di luce visibile di indurre apoptosi. Vi presentiamo un protocollo in vitro PDT progettato per simulare PDT che possono essere utilizzate per studiare le differenze nei parametri di trattamento con la luce e incubazione di PS.

Un approccio In Vitro alla terapia fotodinamica

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

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An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

8.6K Views.  University of California, Davis. Terapia fotodinamica (PDT) è una procedura medica che coinvolge l'incubazione di un fotosensibilizzatore esogenicamente applicata (PS) seguita dalla fotoattivazione di luce visibile di indurre apoptosi. Vi presentiamo un protocollo in vitro PDT progettato per simulare PDT che possono essere utilizzate per studiare le differenze nei parametri di trattamento con la luce e incubazione di PS.

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l&#39;interruttore di crescita metastatica

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

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Medicina

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi in ​​un modello murino fetale

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic Therapy is a novel approach for a more tumor selective treatment.
Photodynamic Therapy (PDT) that makes use of a nontoxic photosensitizer (PS), which, upon activation with light of a specific wavelength in the presence of oxygen, generates oxygen radicals that elicit a cytotoxic response1. Despite its approval almost twenty years ago by the FDA, PDT is nowadays only used to treat a limited number of cancer types (skin, bladder) and nononcological diseases (psoriasis, actinic keratosis)2.
The major advantage of the use of PDT is the ability to perform a local treatment, which prevents systemic side effects. Moreover, it allows the treatment of tumors at delicate sites (e.g. around nerves or blood vessels). Here, an intraoperative application of PDT is considered in osteosarcoma (OS), a tumor of the bone, to target primary tumor satellites left behind in tumor surrounding tissue after surgical tumor resection. The treatment aims at decreasing the number of recurrences and at reducing the risk for (postoperative) metastasis.
In the present study, we present in vitro PDT procedures to establish the optimal PDT settings for effective treatment of widely used OS cell lines that are used to reproduce the human disease in well established intratibial OS mouse models. The uptake of the PS mTHPC was examined with a spectrophotometer and phototoxicity was provoked with laser light excitation of mTHPC at 652 nm to induce cell death assessed with a WST-1 assay and by the counting of surviving cells. The established techniques enable us to define the optimal PDT settings for future studies in animal models. They are an easy and quick tool for the evaluation of the efficacy of PDT in vitro before an application in vivo.

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

The protocol reported here allows the evaluation of the efficacy of photodynamic therapy (PDT) in cell lines and the optimization of the PDT settings before applying the therapy in animal models.

Citotossico Efficacia della terapia fotodinamica in cellule di osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

A Multi-Modal Approach to Assessing Recovery in Youth Athletes Following Concussion

Concussion is one of the most commonly reported injuries amongst children and youth involved in sport participation. Following a concussion, youth can experience a range of short and long term neurobehavioral symptoms (somatic, cognitive and emotional/behavioral) that can have a significant impact on one&#8217;s participation in daily activities and pursuits of interest (e.g., school, sports, work, family/social life, etc.). Despite this, there remains a paucity in clinically driven research aimed specifically at exploring concussion within the youth sport population, and more specifically, multi-modal approaches to measuring recovery. This article provides an overview of a novel and multi-modal approach to measuring recovery amongst youth athletes following concussion. The presented approach involves the use of both pre-injury/baseline testing and post-injury/follow-up testing to assess performance across a wide variety of domains (post-concussion symptoms, cognition, balance, strength, agility/motor skills and resting state heart rate variability). The goal of this research is to gain a more objective and accurate understanding of recovery following concussion in youth athletes (ages 10-18 years). Findings from this research can help to inform the development and use of improved approaches to concussion management and rehabilitation specific to the youth sport community.

This article provides an overview of a multi-modal approach to assessing recovery following concussion in youth athletes. The described protocol uses pre- and post-concussion assessment of performance across a wide variety of domains and can inform the development of improved concussion rehabilitation protocols specific to the youth sport community.

Un approccio multi-modale per Valutare recupero negli atleti giovanili seguito Commozione cerebrale

Concussion is one of the most commonly reported injuries amongst children and youth involved in sport participation. Following a concussion, youth can ...

A Neuroscientific Approach to the Examination of Concussions in Student-Athletes

Concussions are occurring at alarming rates in the United States and have become a serious public health concern. The CDC estimates that 1.6 to 3.8 million concussions occur in sports and recreational activities annually. Concussion as defined by the 2013 Concussion Consensus Statement &#8220;may be caused either by a direct blow to the head, face, neck or elsewhere on the body with an &#8216;impulsive&#8217; force transmitted to the head.&#8221; Concussions leave the individual with both short- and long-term effects. The short-term effects of sport related concussions may include changes in playing ability, confusion, memory disturbance, the loss of consciousness, slowing of reaction time, loss of coordination, headaches, dizziness, vomiting, changes in sleep patterns and mood changes. These symptoms typically resolve in a matter of days. However, while some individuals recover from a single concussion rather quickly, many experience lingering effects that can last for weeks or months. The factors related to concussion susceptibility and the subsequent recovery times are not well known or understood at this time. Several factors have been suggested and they include the individual&#8217;s concussion history, the severity of the initial injury, history of migraines, history of learning disabilities, history of psychiatric comorbidities, and possibly, genetic factors. Many studies have individually investigated certain factors both the short-term and long-term effects of concussions, recovery time course, susceptibility and recovery. What has not been clearly established is an effective multifaceted approach to concussion evaluation that would yield valuable information related to the etiology, functional changes, and recovery. The purpose of this manuscript is to show one such multifaceted approached which examines concussions using computerized neurocognitive testing, event related potentials, somatosensory perceptual responses, balance assessment, gait assessment and genetic testing.

There is great variability in an individual&#8217;s risk for concussion and their corresponding recovery. A multifaceted approach to concussion evaluation is warranted; including baseline testing of athletes before participation in sport and timely evaluation post injury. The goal of this protocol is to provide an appropriate multifaceted approach to examine concussions.

Un approccio neuroscientifica all&#39;esame di traumi in studenti-atleti

Concussions are occurring at alarming rates in the United States and have become a serious public health concern. The CDC estimates that 1.6 to 3.8 ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

preparazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Un metodo per la quantificazione degli arti superiori performance nella vita quotidiana che utilizzano accelerometri

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un<em&gt; In vitro</em&gt; Strumento di screening nella ricerca acustica

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Designing CAD/CAM Surgical Guides for Maxillary Reconstruction Using an In-house Approach

Computer-aided design/computer-assisted manufacturing (CAD/CAM) is now being evaluated as a preparative technique for maxillofacial surgery. Because this technique is expensive and available in only limited areas of the world, we developed a novel CAD/CAM surgical guide using an in-house approach. By using the CAD software, the maxillary resection area and cutting planes and the fibular cutting planes and angles are determined. Once the resection area is decided, the necessary faces are extracted using a Boolean modifier. These superficial faces are united to fit the surface of the bones and thickened to stabilize the solids. Not only the cutting guides for the fibula and maxilla but also the location arrangement of the transferred bone segments is defined by thickening the superficial faces. The CAD design is recorded as .stl files and three-dimensionally (3-D) printed as actual surgical guides. To check the accuracy of the guides, model surgery using 3-D-printed facial and fibular models is performed. These methods may be used to assist surgeons where commercial guides are not available.

Methods for designing a computer-aided design/computer-aided manufacturing (CAD/CAM) surgical guide are shown. Cutting planes are separated, united, and thickened to easily visualize the necessary bone transfer. These designs can be three-dimensional printed and checked for accuracy.

Progettazione CAD/CAM di guide chirurgiche per ricostruzione mascellari utilizzando un approccio in-House

Computer-aided design/computer-assisted manufacturing (CAD/CAM) is now being evaluated as a preparative technique for maxillofacial surgery. Because this ...