Questo metodo è progettato per rispondere a domande chiave nel campo della biochimica inorganica, su come mantenere l'attività enzimatica nelle proteine che contengono metalli sensibili all'ossigeno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ti aiuta a visualizzare modi in cui puoi mantenere il metallo di una proteina nel suo stato ridotto. Generalmente, gli individui nuovi a questa tecnica faranno fatica perché è difficile mantenere materiali e reagenti completamente anaerobici.
24 ore dopo aver introdotto l'espressione proteica, raccogliere le cellule per centrifugazione e rimescolare il pellet di cellule batteriche in 20 millilitri di tampone di colonna di amilosio per 1,5 litri di crescita. Aggiungere un milligrammo di glisozima alla sospensione cellulare e mescolare le cellule per 20 minuti sul ghiaccio. Al termine dell'incubazione, lisciviare la soluzione cellulare rimescolata tramite omogeneizzazione ad alta pressione con da tre a cinque passaggi a circa 15.000 psi e trasferire la proteina in un tubo di centrifuga da 50 millilitri.
Sciacquare lo spazio della testa con azoto per un minuto e centrifugare il lysate cellulare per rimuovere i detriti insolubili. Trasferire il supernatante in almeno un tubo da 50 millilitri e limitare il lysate con un setto di gomma. Utilizzando un ago calibro 20, far bollare lentamente il gas azoto attraverso la soluzione per due minuti per spostare l'ossigeno.
Quindi, avvolgere il setto con pellicola di paraffina, fissare il Parafilm con filo di rame e posizionare il supernatante nella scatola dei guanti con i materiali della colonna. Quando il solvente si trova appena sopra il letto di resina, in una colonna di amilosio precedentemente preparata, caricare 50 millilitri di proteine supernatanti sulla colonna, raccogliendo il flusso in frazioni di cinque millilitri sotto azoto moderatamente pressurizzato a circa cinque millilitri al minuto. Una volta eluito tutto il flusso, lavare la colonna con altri tre volumi di colonna di buffer di colonna amilosio.
Aggiungere cinque CV di tampone di eluizione, quindi raccogliere manualmente frazioni di tre millilitri in provette di vetro sotto azoto moderatamente pressurizzato. Testare le soluzioni per la presenza di ossigeno con solfato di ammonio ferroso e ditiothreitol. La soluzione diventerà blu scuro o nero se è presente ossigeno, come il tubo a destra.
La presenza di ossigeno si tradurrà in proteine purificate a bassa attività catalitica. Le soluzioni con ossigeno minimo presente saranno la lavanda o il colore traslucido azzurro, come il tubo a sinistra. Successivamente, utilizzare una linea di azoto esterna per pressurizzare la camera cellulare mescolata e concentrare la proteina a 50 millilitri a una velocità di agitazione moderata due volte.
Quindi, concentrare la proteina a 10 millilitri e filtrare la proteina concentrata attraverso un filtro siringa da 0,45 micrometri-pori. Aliquot 150 microlitri di proteine in singoli tubi di reazione a catena della polimerasi da 200 microlitri. Quindi, rimuovere le aliquote capped dalla scatola dei guanti per il congelamento immediato del flash in azoto liquido e lo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius.
Per desalinizzazione DesB, aggiungere prima tre millilitri di sephadex G-25 Coarse desalting gel a una colonna borosilicata da nove millilitri e lavare la colonna con due volumi di colonna di tampone di desalt degassato. Quando il DesB si è scongelato, caricare la proteina purificata sulla colonna attraverso un processo controllato dalla gravità e scartare il flusso prima di eluire tre gocce di proteine in ciascuna delle 12 fiale, con circa cinque millilitri di tampone dissallamento. Per preparare l'elettrodo di ossigeno, utilizzare le forbici per tagliare un quadrato di carta distanziale di circa 1,5 pollici e tagliare piccoli triangoli su ogni faccia del quadrato, con fessure negli angoli per aiutare nell'avvolgimento dell'elettrodo.
Aggiungere cinque gocce di una soluzione di cloruro di potassio al 50% sulla scanalatura anodica argentata dell'elettrodo e collegare le gocce in modo che formino un anello continuo di soluzione. Aggiungere due gocce della soluzione di cloruro di potassio nella parte superiore dell'elettrodo di platino e posizionare con cura la carta distanziale sopra l'elettrodo di platino, levigando la carta distanziale in modo che non ci siano bolle d'aria. Tagliare un pezzo di membrana PTFE S4 da 30 m lungo circa due pollici e posizionarlo sopra la carta distanziale, rimuovendo i bordi della membrana in modo che siano allineati con l'anello esterno dell'elettrodo.
Utilizzando un applicatore ad O-ring, spingere un piccolo O-ring sopra l'elettrodo per fissare la carta distanziale e la membrana sull'elettrodo e posizionare un O-ring più grande sulla scanalatura circolare dell'elettrodo, facendo attenzione che non ci sia membrana sotto. Far scorrere la camera superiore dell'elettrodo sulla base e avvitare i due pezzi insieme. Posizionare l'elettrodo assemblato sulla sua base e collegare l'elettrodo al sistema di monitoraggio.
Per determinare la velocità di reazione enzimatica, utilizzare un elettrodo di tipo Clark sensibile all'ossigeno, con integrazione computerica per misurare il consumo di ossigeno tramite l'unità di controllo degli elettrodi. Aggiungere un millilitro di tampone Tris nel volume appropriato del substrato alla camera dell'elettrodo e mescolare la soluzione per 10 secondi. Dopo 10 secondi, sigillare lentamente la camera con lo stantuffo e avvitare la parte superiore verso il basso.
Utilizzare un tessuto pulito per assorbire il liquido in eccesso spostato dalla camera e consentire all'elettrodo di equilibrare dove può produrre una misurazione stabile della concentrazione di ossigeno nella soluzione per almeno un minuto. Successivamente, utilizzare una siringa a tenuta di gas da 10 microliter per aggiungere circa un microlitro di enzima alla camera dell'elettrodo attraverso lo stantuffo e raccogliere i dati sulla velocità. Una volta raccolta tutta la velocità per una determinata concentrazione di substrato, utilizzare un tubo di plastica collegato a un pallone sottovuoto a braccio laterale per svuotare la camera dell'elettrodo e sciacquare ripetutamente la camera per quattro o sei cicli con acqua.
Quindi, impostare la soluzione nell'elettrodo come appena dimostrato, utilizzando una nuova concentrazione di substrato. L'analisi del gel SDS-PAGE delle singole frazioni dalla purificazione del costrutto di fusione proteica legante DesB-maltosio rivela l'isolamento di un prodotto proteico puro, a parte la presenza di prodotti di dominio di proteine leganti DesB e maltosio che si scisso l'uno dall'altro. Una volta effettuate tutte le misurazioni cinetiche, l'attività di DesB con gallato, ad esempio, può essere ottenuta misurando il tasso di consumo di ossigeno in concentrazioni gallate variabili.
Al contrario, il tasso di inibizione di DesB con quattro nitrocatecole può essere determinato osservando la riduzione del tasso di consumo di ossigeno di DesB con gallato millimolare in presenza di concentrazioni variabili di quattro nitrocatecole, indicando, ad esempio, che il quattro nitrocatecole inibisce il consumo di ossigeno e quindi la reazione desb. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo studio degli enzimi diossigenasi ferroso-dipendenti, può essere applicato ad altri sistemi, come altri metalloenzimi. Non dimenticare che lavorare all'interno di una scatola portaoggetti può essere impegnativo, quindi fai attenzione a non affrettarti durante l'esecuzione di questa tecnica.
