Questo protocollo consente la valutazione della funzione mitocondriale all'interno del nervo mediante parcellazione dei mitocondri isolati, una procedura impegnativa in un piccolo tessuto che contiene un numero limitato di mitocondri. La tecnica fornisce la possibilità di analizzare contemporaneamente le funzioni dei mitocondri come il consumo di ossigeno e la produzione di ROS in un mitocondrio conservato in situ. Con più substrati, inibitori e protocolli di progettazione uncoupler.
Diverse malattie condividono la funzione mitocondriale, in particolare le neuropatie indotte dal diabete di tipo due o dalla chemioterapia. In queste malattie, le menomazioni della fosforilazione ossidativa mitocondriale sono l'unico segno che determina lo sviluppo della malattia. Questo metodo fornisce approfondimenti in neurobiologia, biochimica e farmacologia, con lo studio dei meccanismi della malattia mitocondriale, la ricerca di terapie, come i booster mitocondriali o il dolore neuropatico migliorato.
Per iniziare, calibrare i sensori di ossigeno pipettando 2,1 millilitri di tampone MR in ciascuna camera. Chiudilo con i tappi e aspira l'aria nella camera fino a formare una bolla. Mescolare a 37 gradi Celsius per un'ora in modalità di calibrazione fino a quando il flusso di ossigeno per massa si stabilizza.
Utilizzando il software HRR eseguire una calibrazione dell'aria dei sensori di ossigeno polarografici secondo le istruzioni del produttore. Per la preparazione dei tessuti, posizionare il nervo sciatico in una capsula di Petri con abbastanza tampone TP per coprirlo. Tenere un'estremità del nervo con una pinza e con un altro paio di pinze estrarre i fasci nervosi orizzontalmente.
In primo luogo, trasferire il tessuto visualizzato in un piccolo piatto contenente un tampone TP millilitro per la permeabilizzazione dei tessuti. Per iniziare la permeabilizzazione, trasferire il tessuto con pinza su un altro piatto contenente un millilitro di tampone TP, contenente 50 microgrammi per millilitro di saponina. Posizionare la piastra in uno shaker a micropiastre e lasciarla mescolare delicatamente per 30 minuti.
Quindi, trasferire il tessuto con una pinza in un piatto fresco contenente un tampone MR millilitro e lasciarlo mescolare delicatamente per 10 minuti. Trasferire il tessuto con pinza in una camera HRR calibrata. Riempire le camere HRR con 2,1 millilitri di buffer MR.
Aggiungere Amplex Red e perossidasi a una concentrazione finale di cinque micromolari e due unità per millilitro, rispettivamente. Quindi, aggiungere il nervo sciatico permeabile. Collegare i sensori fluorescenti dello strumento.
Quindi, spegni le luci nella sezione di controllo del software e fai clic su Connetti all'ossigrafo "Vai a modificare i protocolli" nel software e inserisci il peso del tessuto. Vai al layout e scegli l'opzione "flusso specifico per unità campione". Quindi selezionare i grafici per accedere contemporaneamente alla lettura del consumo di ossigeno e, se necessario, alla produzione di perossido di idrogeno.
Attendere circa 10 minuti. Iniettare due impulsi di perossido di idrogeno, ciascuno ad una concentrazione finale di 260 micromolari per la calibrazione della camera. Iniettare 20 microlitri di succinato, un substrato del complesso mitocondriale II, per attivare il sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale.
Aggiungere 20 microlitri di ADP per attivare la sintesi di ATP. In sequenza, aggiungere cinque microlitri del citocromo c come indicatore dell'integrità della membrana. Titolare con aliquote di 0,2 microgrammi per millilitro di oligomicina fino a quando non si osserva un'ulteriore diminuzione del consumo di ossigeno.
Titolare con aliquote di 0,5 micromoli per litro FCCP, il disaccoppiatore mitocondriale, fino a quando non si osserva un ulteriore aumento del consumo di ossigeno. Per terminare l'esperimento iniettare due microlitri di antimicina A, fare una concentrazione finale di cinque millimolari e attendere che il flusso si stabilizzi. Vai alla barra dei comandi.
Cerca multisensoriale"nel software. Fare clic su Control"quindi premere Salva file" e disconnettersi. Aprire il file salvato e selezionare il flusso di ossigeno per vassoi di massa per ottenere i risultati sperimentali del consumo di ossigeno.
Selezionare manualmente la finestra tra le iniezioni premendo il tasto Maiusc più il pulsante sinistro del mouse. Vai ai segni e seleziona le statistiche per visualizzare i risultati per ogni iniezione di substrati, inibitori e protocollo di disaccoppiamento. Per la produzione di perossido di idrogeno eseguire la stessa procedura con la traccia di pendenza dell'amplificatore.
La diminuzione del potenziale di membrana promossa dall'attività dell'ATP sisidasi ha accelerato il consumo di ossigeno. L'aggiunta del citocromo C esogeno ha promosso solo una stimolazione minima della respirazione, certificando l'integrità della membrana esterna mitocondriale per questa preparazione. Sono stati registrati flussi assoluti di ossigeno e solo un aumento del 6,3% è stato osservato nella respirazione, indicando una buona qualità della preparazione del tessuto.
Il consumo di ossigeno e la produzione di ROS sono stati misurati simultaneamente in presenza di diversi substrati che forniscono carburante per il sistema di trasporto degli elettroni. L'aggiunta di piruvato e malato per il complesso mitocondriale I ha aumentato la respirazione. E l'ulteriore aggiunta di succinato per il complesso II aumenta anche il consumo di ossigeno.
Pertanto altri substrati potrebbero essere testati. Anche la produzione di ROS è aumentata, indicando la perdita di ossigeno dal sistema di trasporto degli elettroni. L'aggiunta di adenosina difosfato nella concentrazione di saturazione ha aumentato il consumo di ossigeno guidando la formazione di ATP e diminuendo la produzione di ROS.
Al contrario, l'oligotilazione ha ridotto il consumo di ossigeno e aumentato la produzione di ROS. Ciò ha suggerito che il nervo sciatico permeablizzato potrebbe replicare la relazione standard nella fisiologia mitocondriale. L'aggiunta di FCCP e retinone, allineati con i cambiamenti attesi del flusso di ossigeno, confermano che la fisiologia mitocondriale e il profilo bioenergetico sono stati preservati nel nervo sciatico permeablizzato.
Il passo più importante è preparare delicatamente la sezione del tessuto, assicurarsi che tutte le aperture della camera siano adeguatamente pulite. Le alterazioni della funzione dei mitocondri potrebbero essere dovute a disfunzioni o a un numero mitocondriale inferiore. pertanto si raccomanda l'attività della sintasi citata e la conferma del contenuto di DNA mitocondriale mediante PCR.
