La ricerca finanziata dalla NSF award MCB-1021384.

1. Preparazione del Buffer anaerobico <ol><li> Preparare 1 L di tampone fosfato di potassio 100 mM, pH 7,5. Versare 250 mL di tampone in un pallone da 500 ml Büchner con una barra agitatrice. </li><li> Sigillare il pallone con un tappo di gomma e metterlo su un piatto scalpore. Collegare il tubo corto del pallone ad una linea Schlenk. </li><li> Degasare il tampone sotto vuoto per 5 ore a temperatura ambiente con agitazione. Durante questo periodo di tempo, effettuare 5 turni consecutivi di degasaggio sotto vuoto e lavaggio con argon ogni ora. </li><li> Lavare il pallone con argon per 10 secondi e scollegarlo dal collettore di aspirazione. Porre il pallone all&#39;interno del vano portaoggetti. </li><li> Lasciare il pallone aperto nel vano portaoggetti durante la notte con agitazione vigorosa. </li></ol> 2. Rimozione di ossigeno da Stopped-flow del sistema <ol><li> Preparare 1 L di acetato di sodio 0,1 M, pH 5,0. Versare 125 ml di questo tampone in un pallone da 250 ml Büchner ed eseguire operazioni 1,2-1,4. </li><li> Pesare 5mg glucosio ossidasi da Aspergillus niger (181.300 U / g) e 0,9 g di glucosio usando un tubo Eppendorf 1,5 mL e 50 mL Falcon tubo conico, rispettivamente. Posizionare entrambi i contenitori nel vano portaoggetti. </li><li> Sciogliere glucosio ossidasi e glucosio in 50 mL di acetato di sodio anaerobica 0,1 M, pH 5,0 (concentrazioni finali di 18,13 U / ml e 100 mm, rispettivamente). Riempire le siringhe serbatoio con questa soluzione (Figura 1). </li><li> Assicurarsi che le valvole di azionamento sono in posizione &quot;carico&quot; e riempire le siringhe di azionamento (Figura 1). Girare la valvola F in posizione &quot;drive&quot;. Svuotare la siringa fermata cliccando sul vuoto nel Pro-Data software di controllo. Spingere il buffer da unità F siringa attraverso il circuito del flusso manualmente sollevando la ram corrispondente unità. Ripetere questa operazione dieci volte in totale. Eseguire la stessa procedura con le altre tre siringhe di unità. Attendere un&#39;ora. </li><li> Sostituire la soluzione delle siringhe serbatoio con lo stesso tampone conteniNing glucosio ossidasi e glucosio. Ripetere il punto 2.4. </li><li> Ripetere il passaggio 2.5 e permettono la soluzione di stare nel sistema di flusso durante la notte. </li><li> Dopo una notte di incubazione, ripetere il passo 2.5. </li></ol> 3. Preparazione del tampone di ossigeno saturo <ol><li> Preparare potassio 100 mM tampone fosfato (pH 7,5) e 50 mL versare in un flacone da 50 ml con una barra agitatrice. Chiudere la fiala con un tappo Wheaton e un sigillo in alluminio Wheaton. </li><li> Posizionare il flaconcino su ghiaccio. Immergere un lungo ago collegato ad un serbatoio contenente ossigeno al 100% nella soluzione. Inserire un altro ago corto attraverso il tappo del flaconcino come uno sfogo. </li><li> Bubble la soluzione con ossigeno al 100% per 1 ora con agitazione. </li><li> Prima di tutto rimuovere l&#39;ago corto dal flaconcino e attendere 10 secondi prima di rimuovere l&#39;ago lungo. Posizionare il flacone chiuso nel vano portaoggetti. </li></ol> 4. Preparazione della soluzione NADPH <ol><li> Pesare 1 mg di NADPH in una provetta da 1,5 ml Eppendorf e posizionare it nel vano portaoggetti. </li><li> Sciogliere il NADPH in 300 pl di anaerobica tampone fosfato di potassio 100 mM, pH 7,5. Rimuovere 30 pl di questa soluzione dal vano portaoggetti per determinare la concentrazione di NADPH con uno spettrofotometro (ε 340 nm = 6.270 M -1 cm -1). </li></ol> 5. Rimozione di ossigeno dalla soluzione enzimatica <ol><li> Prendete 400 ml di soluzione enzimatica magazzino dal freezer e scongelare nel vano portaoggetti. La soluzione madre enzima (360 uM) è stato precedentemente preparata in 100 mM tampone fosfato di potassio (pH 7,5) contenente 100 mM NaCl, e congelati in azoto liquido. </li><li> Trasferire la soluzione enzimatica in un flacone da 25 ml con ancoretta, chiudere la fiala con un tappo Wheaton e un sigillo in alluminio Wheaton e togliere dal cassetto portaoggetti. </li><li> Posizionare il flaconcino su ghiaccio e collegarlo ad una linea di Schlenk inserendo un ago attraverso il tappo del flacone. </li><li> Degassare la soluzione enzimatica eseguendo 5 turni consecutivi didegasaggio sotto vuoto e lavaggio con argon ogni 20 minuti per 1 ora. </li><li> Sciacquare la fiala con argon per 10 secondi e scollegarlo dal collettore di aspirazione. Posizionare il flaconcino su ghiaccio all&#39;interno del vano portaoggetti. </li></ol> 6. Riduttiva Half-reazione: Flavin Riduzione Monitoring <ol><li> Preparare la stopped-flow strumento e la Pro-dati software di controllo per singola modalità di mescolamento seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Attivare un bagno di acqua circolante (15 ° C). Rimuovere ossigeno dall&#39;acqua mediante gorgogliamento di azoto attraverso di essa per 20 minuti. Ciò impedisce la contaminazione da ossigeno attraverso il circuito di flusso. </li><li> Mantenere la temperatura delle siringhe di azionamento e la cella di osservazione a 15 ° C collegando l&#39;alloggiamento bagno d&#39;acqua del stopped-flow al bagno circolante. </li><li> Nella finestra Pannello di controllo del Pro-Data Array software Photodiode controllo di selezione, trigger esterno (per attivare stopped-flow operativo), e LogaritHMIC scala. </li><li> Avviare il Pro-Data software di visualizzazione e definire la directory dove i file di dati verranno memorizzati. </li><li> Sostituire la soluzione del serbatoio siringhe C e F anaerobica con tampone fosfato di potassio 100 mM (pH 7,5). Girare la C e le valvole F alla posizione &quot;drive&quot;. Svuotare la siringa fermata facendo clic su Svuota nella Pro-Data software di controllo. Spingere il buffer da entrambe le siringhe guida attraverso il circuito del flusso manualmente sollevando l&#39;unità corrispondente ariete cinque volte in totale (fare clic su Svuota prima di ogni movimento del pistone). </li><li> Al fine di garantire che glucosio ossidasi è stato rimosso completamente dal circuito di flusso, eseguire il passaggio 6,6 quattro volte in totale. </li><li> Fare clic sul Baseline nella Pro-Data software di controllo. </li><li> Mescolare 100 ml di soluzione enzimatica magazzino di 1100 anaerobica 100 microlitri di tampone fosfato di potassio mM (concentrazione finale dopo la miscelazione nel flusso interrotto di 15 pM). </li><li> Sostituire la soluzione del serbatoio syrF Inge con la soluzione di enzima. Girare la valvola F in posizione &quot;drive&quot;. Svuotare la siringa fermata facendo clic su Svuota nella Pro-Data software di controllo. Spingere la soluzione enzimatica da unità F siringa attraverso il circuito del flusso manualmente aumentando la ram corrispondente unità. Eseguire questo tre volte in totale. Nella Pro-Data software di controllo, impostare il tempo di acquisizione a 60 s. </li><li> Assicurarsi che entrambe le siringhe sono piene di auto con le loro soluzioni corrispondenti e gli arieti unità sono in contatto con siringhe pistoni di azionamento. Girare entrambe le valvole in posizione &quot;drive&quot; e fare clic su Acquisisci nella Pro-Data software di controllo per eseguire l&#39;unità. Ripetere questa operazione due volte di più per ottenere i dati in triplice copia. Questo spettri rendimenti della forma ossidata dell&#39;enzima. </li><li> Utilizzando il valore di A 452 nm ottenuto dalle unità, determinare la concentrazione dell&#39;enzima prima della miscelazione (ε = 452 nm 13.700 M -1 cm -1) e preparare 4 mL di una solutio NADPHn 1,5 volte più concentrato. </li><li> Sostituire la soluzione del serbatoio C siringa con la soluzione di NADPH e di vuoti e riempire la siringa fermata tre volte, come descritto in 6.10. </li><li> Ripetere il passaggio 6.11. Questo spettri rese durante la riduzione dell&#39;enzima. </li></ol> 7. Ossidativo Half-reazione: Flavin Ossidazione Monitoring <ol><li> Preparare la stopped-flow strumento e la Pro-dati software di controllo per doppia modalità di mescolamento seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Ripetere i passaggi 6.2-6.5. </li><li> Sostituire la soluzione nelle quattro siringhe serbatoio anaerobica con tampone fosfato di potassio 100 mM (pH 7,5). Girare la valvola F in posizione &quot;drive&quot;. Svuotare la siringa fermata facendo clic su Svuota nella Pro-Data software di controllo. Spingere il buffer dalla unità F siringa attraverso il circuito del flusso manualmente sollevando la ram corrispondente unità. Eseguire questa operazione cinque volte in totale con ogni siringa unità. </li><li> Eseguire il passaggio 7.3 quattro volte in total di rimuovere completamente i contenuti dal circuito di flusso. </li><li> Clicca Baseline nella Pro-Data software di controllo. </li><li> Mescolare 200 ml di soluzione enzimatica magazzino con 1000 anaerobica 100 microlitri di tampone fosfato di potassio mM (concentrazione finale dopo la miscelazione nel flusso interrotto di 15 pM). </li><li> Sostituire la soluzione di siringa serbatoio A con la soluzione di enzima. A Girare la valvola nella posizione &quot;drive&quot;. Svuotare la siringa fermata facendo clic su Svuota nella Pro-Data software di controllo. Spingere la soluzione enzimatica dalla siringa drive A attraverso il circuito del flusso manualmente aumentando la ram corrispondente unità. Eseguire questa operazione per tre volte in totale. Nella Pro-Data software di controllo, impostare il tempo di ritardo di 0,5 s e il tempo di acquisizione a 60 s. </li><li> Assicurarsi che tutte le siringhe di azionamento sono riempiti con le relative soluzioni e il montone disco sono in contatto con siringhe pistoni di azionamento. Girate tutte le valvole in posizione &quot;drive&quot; e fare clic su Acquisisci nella Pro-Datun software di controllo per eseguire l&#39;unità. Ripetere questa operazione altre due volte per ottenere i dati in triplice copia. Questo spettri rendimenti della forma ossidata dell&#39;enzima. </li><li> Sostituire la soluzione della siringa B serbatoio con una soluzione NADPH 1,5 volte più concentrato rispetto alla soluzione enzimatica in siringa A. Girare la valvola B in posizione &quot;drive&quot; e svuotare e riempire la siringa fermata tre volte, come descritto in 7.7. </li><li> Sostituire la soluzione del serbatoio siringa C con tampone ossigenato. Girare la valvola C in posizione &quot;drive&quot; e svuotare e riempire la siringa fermata tre volte, come descritto in 7.7. Nella Pro-Data software di controllo, impostare il tempo di ritardo e l&#39;acquisizione a 15 e 900 s, rispettivamente. </li><li> Ripetere il punto 7.8. Questo spettri rese durante la riossidazione del enzima completamente ridotto. </li></ol> 8. Analisi dei dati <ol><li> Avviare il Pro-Data software di conversione. Fare clic sull&#39;icona Opzioni e selezionare Salva in ProDataCSV. </li><li> Apertola directory in cui sono stati memorizzati i file di dati. Trascinare i file alla APL Pro-Data finestra convertitore. I dati saranno automaticamente salvati come file in formato CSV nella stessa directory. </li><li> Aprire i file in formato CSV utilizzando Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Normalizzare la linea di base dei stopped-flow tracce sottraendo l&#39;assorbimento corrispondente a 700 nm. </li><li> Analizzare le tracce corrette utilizzando Kaleidagraph (Software Synergy, Reading, PA) inserendo la trama del assorbanza al massimo in funzione del tempo corrispondente alla funzione appropriata esponenziale. Come mostrato in Figura 2B, l&#39;assorbanza a 452 nm è stata tracciata in funzione del tempo per determinare il tasso di riduzione flavina dopo la miscelazione e l&#39;enzima NADPH in stopped-flow strumento. In questo caso, il migliore adattamento dei dati sono stati ottenuti utilizzando una doppia equazione esponenziale e tassi di 0,65 e 0,23 s -1 sono stati calcolati per la prima e seconda fase di riduzione, resture rispettivamente. Per determinare il tasso di formazione del C4a-hydroperoxyflavin intermedio e la riossidazione dopo reazione con l&#39;enzima ridotto ossigeno, abbiamo analizzato le stopped-flow tracce a 380 e 452 nm, rispettivamente (Figura 3B). Utilizzo di una singola equazione esponenziale, abbiamo calcolato tassi di 1,4 e 0,006 s -1 per il primo passo e secondo ossidativo semireazione, rispettivamente. </li></ol> 9. Risultati rappresentativi I risultati degli esperimenti descritti nelle sezioni precedenti mostrano come il riduttiva semi-reazione di A Sida f può essere monitorata misurando le variazioni di assorbanza a 452 nm, che corrispondono ai cambiamenti nello stato redox della flavina. Il tasso di questo stadio può essere determinato inserendo i dati per l&#39;equazione appropriata (Figura 2; Fase 8,4). Il tasso di riduzione ottenuto (0,65 s -1) è simile al valore k calcolato con gattoallo stato stazionario esperimenti 2, suggerendo che la riduzione è il fattore limitante della reazione. Sfruttando la modalità doppia miscelazione del stopped-flow, il tasso di ossidazione e gli intermedi in questo mezzo reazione può essere determinato (Figura 3; Fase 8,4). Nella reazione catalizzata dalla Sida A f, la C4a-hydroperoxyflavin è chiaramente rilevato (λ max di 380 nm), e il tasso di formazione e decadimento può essere calcolato. La lentezza della riossidazione ottenuto (0,006 s -1) indica che il C4a-hydroperoxyflavin è molto stabile in assenza della ornitina. <img alt="Schema 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> Schema 1. Meccanismo di un Sida f. L&#39;anello isoallozaxine del cofattore FAD viene mostrato. Il ossidato flavina (A) si lega a NADPH (B) e reagisce per formare ridotta Flavin e NADP + (C). Dopo la reazione con ossigeno molecolare e di legameornitina, il C4a-hydroperoxyflavin si forma (D). Questa è la specie idrossilante. Dopo idrossilazione della ornitina, il hydroxyflavin (E) deve essere disidratato per formare l&#39;enzima ossidato. NADP + rimane vincolato per tutto il ciclo catalitico ed è il prodotto ultimo ad essere rilasciato (F). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> Figura 1. La stopped-flow strumento. A) Immagine dei componenti del Photophysics Applied SX20 stopped-flow spettrofotometro. B) Immagine della centrale di trattamento del campione. C) Schema del circuito di flusso in doppia modalità di mescolamento. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> Figura 2. Riduzione anaerobica di Sida con NADPH in stopped-flow strumento. A) modifiche spettrali registrati dopo mescolando volumi uguali di 30 pm Sida NADPH e 45 micron. Il primo spettro (ossidato Sida) e spettro ultimo (completamente ridotto SidA) è evidenziata in blu e rosso, rispettivamente. B) traccia assorbanza a 452 nm registrate in funzione del tempo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> Figura 3. Ossidazione di Sida in stopped-flow strumento. A) i cambiamenti spettrali registrati dopo la miscelazione volumi uguali completamente ridotta Sida e buffer ossigenato. Le concentrazioni finali erano di 15 pM Sida, NADPH 22,5 pM, ossigeno e 0,95 mM. Lo spettro registrato a 0,034, 4,268, e 727,494 s corrisponde all&#39;enzima completamente ridotta, il C4a-hydroperoxyflavin intermedio (λ max di 380 nm), e l&#39;enzima ossidato (λ max di 450 nm), rispettivamente. B) traccia assorbanza a 382 e 452 nm registrata in funzione del tempo.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Enzimi che catalizzano reazioni redox solito contengono cofattori quali hemes e flavine che subiscono variazioni di assorbanza significativi durante il ciclo catalitico. La forma ossidata del flavina presenta assorbanza massimi a ~ 360 e 450 nm, e la sua riduzione è tipicamente monitorata seguendo la diminuzione di assorbanza a 450 nm 7. In generale, alcuni transitori intermedi sono presenti, ma la forma e il decadimento troppo veloce per essere misurato in spettrofotometri regolari. Utilizzando il Applied Photophysics SX20 stopped-flow spettrofotometro (o strumenti simili), è possibile misurare le variazioni di assorbanza nella scala temporale millisecondo (tempo morto, 2 ms). Qui abbiamo studiato le riduttive e ossidativo mezze reazioni del flavina-dipendente monooxygenase A Sida f, che funge da modello. Il tasso di trasferimento di idruro è stata determinata misurando la variazione di assorbanza a 452 nm dopo la miscelazione con l&#39;enzima NADPH in condizioni anaerobiche. Successivamente, tenendo advantage della modalità doppia miscelazione del stopped-flow strumento, l&#39;enzima è stato fatto reagire con NADPH, fino a completa riduzione è stata ottenuta, quindi il enzimatica ridotta-NADP + complesso è stato miscelato con ossigeno. Seguendo questa procedura, è possibile rilevare transitori intermedi flavina ossigenati e per misurare i tassi di formazione e di decadimento. L&#39;identificazione di questi intermedi fornisce dati sperimentali sulla natura delle specie reattive di catalisi. Nel caso di Sida A f, la formazione del C4a-hydroperoxyflavin (tipicamente monitorato a 370-380 nm), che è la specie idrossilante. Inoltre, misurando la velocità costante di ogni passo permette di ottenere informazioni sul fattore limitante della reazione e aiutano a chiarire i meccanismi cinetici e chimico dell&#39;enzima. In generale, gli approcci simili possono essere usati per altre flavoenzymes, o proteine ​​per le quali assorbanza cambiamenti intercorsi, come proteine ​​che contain eme, piridossal-fosfato, o di ferro non-eme 8-10. Una limitazione di questo metodo è che grandi quantità di enzima purificato sono richiesti, ma questo può essere superato utilizzando un sistema di espressione con alte rese. Si determina la concentrazione proteica ottimale per spettri registrazione utilizzando proteine ​​abbastanza così che un segnale sufficientemente forte può essere osservato, ma non troppo enzima che non viene sprecato. Tipicamente, la concentrazione più bassa enzima per flavina contenenti enzimi utilizzati in stopped-flow esperimenti è 6-10 uM (dopo la miscelazione) e viene determinata utilizzando il coefficiente di estinzione molare corrispondente dell&#39;enzima. Nel caso di Sida A f, la percentuale di FAD enzima legato è 50-65% 2. Apo-proteina è considerata inattiva in questi esperimenti perché un cofattore FAD legato è necessaria per la catalisi. Un&#39;altra possibile limitazione di questo metodo è se i processi in un enzima avvenire più velocemente di 2 ms (tempo morto di stopped-flow) che non verrà osservato, ma there sono riportate le strategie in cui i tassi può essere diminuita per superare questo problema. Un esempio di questo include l&#39;utilizzo di una elevata concentrazione di NaCl nella reazione di ferredossina-NADP + riduttasi 11. Il lavaggio di ossigeno dal circuito flusso del stopped-flow è spesso un passo difficile in questo esperimento e richiede una particolare attenzione. La glucosio ossidasi-glucosio sistema qui descritto viene utilizzato con successo nella maggior parte dei laboratori in quanto è un metodo efficace ed economico. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi che includono la produzione di H 2 O 2 e per alcune applicazioni alternative come protocatechuate-diossigenasi protocatechuate sistema deve essere considerato 12. L&#39;utilizzo di un glove box anaerobico rende più facile assicurare condizioni anaerobiche, ma non è essenziale. Ossigeno deve essere rimosso dal circuito di flusso del stopped-flow, come si vuole l&#39;enzima di ridurre in assenza di ossigeno o di reagire con ossigeno a concentraziones che abbiamo specificato. Sebbene il stopped-flow è nel vano portaoggetti, vi è ossigeno nel circuito di flusso se usato buffer aerobiche in esperimenti precedenti. Oltre alle misurazioni di assorbanza, saggi di dicroismo circolare e fluorescenza può essere eseguita in Applied Photophysics SX20 stopped-flow spettrofotometro con relativi accessori.

<table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzatura generale di laboratorio </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Pompa del vuoto </td><td> Welch </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner fiaschi </td><td> Pescatore </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Mescolare bar </td><td> Pescatore </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Mescolare piastre </td><td> Pescatore </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk linee </td><td> Kontes Glass </td><td> - </td></tr><tr><td> Serbatoio di Argon </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Serbatoio di azoto </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> Azoto serbatoio, ultra elevato grado di purezza </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> Serbatoio di ossigeno </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5% di idrogeno equilibrio serbatoio di azoto </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 Stop-flow spettrofotometro </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Glove box </td><td> Schivo </td><td> - </td></tr><tr><td> Bagnomaria </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Forniture </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mL tubi BD Falcon </td><td> Pescatore </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 mL tubi conici BD Falcon </td><td> Pescatore </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1.5 mL microcentrifuga Eppendorf tubi </td><td> Pescatore </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 e 25 flaconi di vetro ml </td><td> Pescatore </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Tappi di gomma </td><td> Pescatore </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Alluminio guarnizioni </td><td> Pescatore </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagents </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di potassio, monobasico </td><td> Pescatore </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Fosfato di potassio, dibasico </td><td> Pescatore </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> Sodio Acetato </td><td> Sigma </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> Glucosio ossidasi da A. Niger </td><td> Sigma </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-Glucosio </td><td> Pescatore </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> Pescatore </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-ornitina cloridrato </td><td> Pescatore </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus sideroforo A (Sida) è una monoossigenasi contenente FAD che catalizza l&#39;idrossilazione della ornitina nella biosintesi di siderofori idrossamato che sono essenziali per la virulenza (ad es ferricrocin o N &#39;, N &quot;, N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1. La reazione catalizzata da Sida può essere divisa in riduttive e ossidativo semireazioni (Schema 1). Nella riduttiva semi-reazione, la FAD legato ossidato Sida A f, è ridotta NADPH 2,3. Nella ossidativo semireazione , il cofattore ridotta reagisce con l&#39;ossigeno molecolare per formare un C4a-hydroperoxyflavin intermedio, che trasferisce un atomo di ossigeno per ornitina. Qui, si descrive un procedimento per misurare le tariffe e rilevare le forme spettrali differenti di Sida utilizzando un stopped-flow strumento installato uno glove box anaerobico. Nel stopped-flow strumento, piccoli volumi di reagenti sono rapidamente mista, e dopo che il flusso viene interrotto da thsiringa e arresto (figura 1), le variazioni spettrali della soluzione posta nella cella di osservazione sono registrate nel tempo. Nella prima parte dell&#39;esperimento, si mostra come possiamo usare il stopped-flow strumento in modalità singola, in cui la riduzione anaerobica della flavina in A Sida f da NADPH viene misurata direttamente. Abbiamo quindi utilizzare doppie impostazioni di miscelazione dove A Sida f è prima anaerobicamente ridotto di NADPH per un determinato periodo di tempo in un ciclo di invecchiamento, e poi fatto reagire con ossigeno molecolare in cella di osservazione (Figura 1). Per eseguire questo esperimento, buffer anaerobiche sono necessari perché quando solo la metà riduttiva reazione viene controllata, l&#39;ossigeno nelle soluzioni reagirà con il cofattore ridotta flavina e formano un C4a-hydroperoxyflavin intermedio che infine decadono indietro nel ossidato flavina . Ciò non consente all&#39;utente di misurare accuratamente tassi di riduzione poiché non vi sarebbe turnover completa del EnzYME. Quando il ossidativo semireazione viene studiato l&#39;enzima deve essere ridotto in assenza di ossigeno in modo che solo le passi tra riduzione e ossidazione sono osservati. Uno dei buffer utilizzati in questo esperimento è saturo di ossigeno in modo da poter studiare la ossidativo semi-reazione a concentrazioni più elevate di ossigeno. Questi sono spesso le procedure eseguite quando si studia sia le ossidativi o riduttivi semireazioni con flavina contenenti monossigenasi. La scala di tempo dei pre-steady state sperimentazioni condotte con la stopped-flow è millisecondi a secondi, che consentono la determinazione di costanti di velocità intrinseche e il rilevamento e l&#39;identificazione di intermedi nella reazione 4. Le procedure qui descritte possono essere applicate ad altri flavina-dipendenti monossigenasi. 5,6

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Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Si descrivono l&#39;uso di un stopped-flow strumento per studiare sia riduttive e ossidativo semireazioni di<em&gt; Aspergillus fumigatus</em&gt; Sideroforo A (Sida), un flavina-dipendente monoossigenasi. Abbiamo poi mostrano gli spettri corrispondenti alle specie di cui la reazione di Sida e calcolare le costanti di velocità per la loro formazione.

Monitoraggio dei riduttivo e ossidativa semireazioni di Flavin-Dependent monoossigenasi con Stopped-Flow Spettrofotometria

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

monitoring-reductive-oxidative-half-reactions-flavin-dependent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K Views.  Virginia Polytechnic Institute and State University. Si descrivono l'uso di un stopped-flow strumento per studiare sia riduttive e ossidativo semireazioni di Aspergillus fumigatus Sideroforo A (Sida), un flavina-dipendente monoossigenasi. Abbiamo poi mostrano gli spettri corrispondenti alle specie di cui la reazione di Sida e calcolare le costanti di velocità per la loro formazione.

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Ricerca

Bioingegneria

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the arterial wall lead to tissue injury, which initiates restenosis2-7. This hypothesis needs further investigations including better quantifications of non-uniform strain distribution on the artery following stent implantation. A non-contact surface strain measurement method for the stented artery is presented in this work. ARAMIS stereo optical surface strain measurement system uses two optical high speed cameras to capture the motion of each reference point, and resolve three dimensional strains over the deforming surface8,9. As a mesh stent is deployed into a latex vessel with a random contrasting pattern sprayed or drawn on its outer surface, the surface strain is recorded at every instant of the deformation. The calculated strain distributions can then be used to understand the local lesion response, validate the computational models, and formulate hypotheses for further in vivo study.

Stent-induced arterial strain distributions are characterized using an optical surface strain measurement system. This visualization technique is used to gain insights into the impact of stent implantation on the host vessel.

Monitoraggio dei Mechanics parete durante la distribuzione stent in un recipiente

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Massa Citometria: Protocollo per l&#39;ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental technique and image analysis protocol presented here can also be applied for imaging microscopic bubbles in other fields of research; therefore, it has a wide range of applications. We apply this to image cavitation around dental ultrasonic scalers. It is important to image cavitation to characterize it and to understand how it can be exploited for various applications. Cavitation occurring around dental ultrasonic scalers can be used as a novel method of dental plaque removal, which would be more effective and cause less damage than current periodontal therapy techniques. We present a method for imaging the cavitation bubble clouds occurring around dental ultrasonic scaler tips using a high-speed camera and a zoom lens. We also calculate the area of cavitation using machine learning image analysis. Open source software is used for image analysis. The image analysis presented is easy to replicate, does not require programming experience, and can be modified easily to suit the application of the user.

Cavitation microbubbles are imaged using a high-speed camera attached to a zoom lens. The experimental setup is explained, and image analysis is used to calculate the area of the cavitation. Image analysis is done using ImageJ.

Imaging e quantificazione dell'area delle microbolle in rapido movimento utilizzando una fotocamera ad alta velocità e l'analisi delle immagini

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.