Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla composizione e l'organizzazione dinamica dei complessi proteici fotosintetici nella membrana tilacoide delle piante. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'analisi delle interazioni funzionali tra complessi proteici nativi e chiarisce la plasticità dell'organizzazione complessa proteica in diverse condizioni ambientali. Impostare la seghettatrice in gel di otto centimetri per piastre di 10 centimetri secondo le istruzioni del produttore utilizzando distanziale da 0,75 millimetri.
Posizionare un miscelatore sfumato su una piastra di agitazione e collegarlo alla pompa peristaltica mediante tubi. Attaccare un ago della siringa all'altra estremità del tubo e posizionare l'ago tra il vetro e la piastra di alluminio. Posizionare un agitatore magnetico nella camera pesante.
Preparare soluzioni di acrilammide al 3,5% e al 12,5% in tubi di centrifuga conica da 15 millilitri, come descritto nel protocollo di testo da utilizzare per il gradiente del gel di separazione. Per evitare una polimerizzazione inteme mantenere i tubi di centrifuga sul ghiaccio durante la preparazione delle soluzioni. Aggiungere 5%APS e TEMED subito prima di pippetting le soluzioni al mixer sfumato.
Pipettare le soluzioni al 12,5% alla camera pesante. Rimuovere le bolle d'aria dal canale che collega la camera leggera e pesante aprendo la valvola che collega le due camere consentendo alla soluzione di entrare nella camera luminosa. Chiudere la valvola e pipettare le tracce di soluzione alla camera pesante.
Infine, pipettare la soluzione al 3,5% alla camera luminosa. Accendere l'agitatore magnetico. Aprire le valvole e accendere la pompa peristaltica.
Consentire alle soluzioni in gel di fluire tra il vetro e la piastra di alluminio a una portata di circa 0,5 millilitri al minuto. L'ago deve essere sempre sopra il liquido. Quando le camere pesanti e leggere si sono svuotate riempirle di acqua ultrapura.
E lasciare che l'acqua sovrapponga delicatamente la superficie del gel. La polimerizzazione del gel richiede circa una o due ore a temperatura ambiente. Preparare la soluzione di acrilammide al 3% per il gel impilabile a temperatura ambiente.
Pipettare il gel impilamento sopra il gel di separazione polimerizzato e posizionare un pettine di gel campione tra il vetro e la piastra di alluminio evitando bolle d'aria. Dopo aver permesso al gel di polimerizzare per 30-60 minuti a temperatura ambiente, rimuovere delicatamente il pettine sotto acqua ultrapura. A questo punto il gel può essere conservato a quattro gradi Celsius positivi in condizioni umidi per alcuni giorni.
Diluire i thylakoidi isolati con tampone ghiacciato 25BTH20G a una concentrazione finale di clorofilla di un milligrammo per millilitro. Preparare due tubi per ogni campione di tilacoide per eseguire la solubilizzazione sia beta-DM che digitonina. Ora aggiungi un volume uguale di tampone detergente.
Mescolare delicatamente il detersivo e il campione di thylakoid con una pipetta ed evitare di fare bolle d'aria. Solubilizzare i thylakoids per due minuti sul ghiaccio per la solubilizzazione in beta-DM. Oppure 10 minuti a temperatura ambiente con miscelazione delicata continua su un rocker o uno shaker per la solubilizzazione della digitonina.
Dopo l'incubazione, rimuovere il materiale insolubilizzato mediante centrifugazione a 18.000 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius positivi. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e aggiungere 1/10 di volume di tampone blu brillante Coomassie al campione. Impostare il gel in un sistema di elettroforesi verticale.
Riempire la camera tampone superiore con tampone catodico blu e versare il tampone anodo nella camera tampone inferiore. Caricare i campioni di tilacoide nei pozzi. Avviare l'elettroforesi e aumentare gradualmente la tensione elencata nel protocollo di testo.
Eseguire il gel a quattro gradi Celsius positivi utilizzando una stanza fredda o regolando la temperatura del gel con un sistema di raffreddamento. Cambiare il buffer del catodo blu in un tampone catodo chiaro quando il fronte del campione è migrato circa 1/3 del gel. Dopo l'esecuzione elettroforetica eseguire la scansione del gel con uno scanner fotografico per l'archiviazione delle immagini.
Per eseguire 2-SDS PAGE assemblare il sistema di elettroforesi verticale utilizzando distanziali di un millimetro. Preparare un gel SDS standard con un pettine 2D come descritto nel protocollo di testo. Tagliare la corsia dal gel BN e posizionarla in un tubo da cinque millilitri.
Quindi aggiungere due millilitri di tampone Laemmli e incubare la striscia per 45 minuti con tremori delicati a temperatura ambiente. Posizionare la corsia con l'aiuto di un distanziale sopra il gel evitando bolle d'aria. Pipettare cinque microlitri di marcatore di peso molecolare su uno stretto pezzo di carta da filtro e posizionare la carta nel pozzo standard.
Per sigillare la striscia di gel BN e la carta marcatore versare uno 0,5% di agarosio nel tampone di corsa sopra la striscia di gel e consentirgli di solidificarsi. Eseguire l'elettroforesi secondo i protocolli standard. Dopo la corsa elettroforetica visualizzare le proteine con colorazione SUPRO Ruby o colorazione argento.
Qui sono riportati i risultati rappresentativi dei modelli complessi di proteine tilacoidi di campioni beta-DM e solubilizzati con digitonina. I piccoli complessi migrano più velocemente durante la corsa elettroforetica e si trovano quindi nella parte inferiore del gel. Mentre i grandi complessi si trovano nella parte superiore del gel.
La digitonina generalmente conserva i complessi proteici in gruppi più grandi, mentre il beta DM interferisce con le interazioni proteina-proteina labile tra i complessi. Qui viene presentata la composizione subunità dei complessi proteici dei tilakoidi beta-DM e solubilizzati in digitonina. Le sottounità di ogni complesso si trovano dalla linea verticale sotto il complesso allineato.
In linea di principio, ogni punto nel gel 2D rappresenta una singola proteina. Ma in pratica, diverse proteine della stessa massa molecolare possono essere presenti in un singolo punto. L'identificazione delle macchie si basa sull'analisi della spettrometria di massa.
Dopo aver applicato questa procedura si può continuare con altri metodi come la microscopia elettronica e l'analisi di singole particelle dei complessi proteici eluitati dal gel nativo blu al fine di ottenere intuizioni strutturali sui complessi proteici. Per identificare subunità proteiche sconosciute le singole macchie proteiche da SDS PAGE bidimensionali possono essere analizzate con specifiche di massa. Non dimenticare che lavorare con acrilammide e digitonina può essere estremamente dannoso e precauzioni come indossare guanti protettivi dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
