La terapia genica ex vivo e il trapianto di cellule autologhe per il trattamento degli errori inborni del metabolismo nel fegato è un'importante alternativa alla terapia per questi disturbi. E ci permette non solo di trattare questi disturbi, ma anche di capire la biomassa necessaria per poter ottenere un risultato terapeutico. Questo approccio evita anche le significative conseguenze dell'immunosoppressione e altre conseguenze con diversi tipi di terapie.
Nel contesto attuale, stiamo usando questo approccio per trattare la tirosinemia ereditaria di tipo 1. Tuttavia, l'idea è che questo sarà un approccio piattaforma per trattare una moltitudine di diverse malattie del fegato con alterazione minima. È importante essere in grado di visualizzare questa tecnica perché c'è una certa variabilità quando si tratta di visualizzare l'efficienza della perfusione, che è essenziale per ottenere epatociti vitali per il trapianto.
Procedura chirurgica eseguita da Robert Kaiser e Joseph Lillegard. Isolamento cellulare eseguito da Zeji Du, Bruce Amiot. La purificazione cellulare UAU e la trasduzione ex vivo delle cellule sono state fatte da Caitlin VanLith.
La preparazione degli animali e la preparazione or è stata fatta da Kari Allen e Laurie Hillin. Per eseguire l'ingresso iniziale del sito portuale, eseguire una tecnica Hasson aperta cephalad all'ombelico di un maiale da fattoria bianco anestetizzato, fino a tre mesi, grande. Introduzione di un trocar di 12 millimetri nella cavità addominale, dove è visibile il peritoneo.
Quando il trocar è in posizione, passare un mirino di 5 millimetri e 30 gradi attraverso la porta di ingresso e insufflate l'addome con anidride carbonica a 15 millimetri di mercurio. Sotto visualizzazione diretta con la fotocamera laparoscopica, posizionare 2 porte aggiuntive da 5 millimetri, triangolando sul lobo laterale sinistro del fegato. E posizionare il laparoscopio in una delle nuove porte.
Identificare il segmento laterale sinistro del fegato nel punto della fessura maggiore del lobo sinistro che separa i segmenti mediali e laterale sinistro. E usa una cucitrice chirurgica per fissare le strutture vascolari e la vena epatica lungo questa fessura. Trasmetti il parenchima attraverso questa fessura usando cotere sequenziali e carichi vascolari lunghi 60, 45 o 30 millimetri.
Al termine della resezione, valutare il fegato residuo per garantire un'emostasi adeguata e utilizzare afferratori endoscopici e un sacchetto di recupero del tessuto endoscopico per recuperare la sezione epatica. Ora, rimuovere le porte e utilizzare una sutura zero di dimensione interrotta per la fascia della linea mediana. Una sutura 2-0 in esecuzione per lo strato dermico profondo.
E una sutura 4-0 in esecuzione per lo strato sottocuticolare, per chiudere l'incisione della porta di 12 millimetri nei tre strati. Quindi chiudere le porte di cinque millimetri in uno strato con 2-0 suture. E mettere una medicazione sterile sulle incisioni.
Per l'isolamento degli epatociti, collegare prima una pompa peristaltica impostata per fornire le soluzioni di dispersione, mantenute in un bagno d'acqua di 43 gradi Celsius, ai cateteri da posizionare nei grandi vasi esposti della sezione epatica. Innescare la pompa e i tubi con la perfusione due soluzioni, fino a una posizione di arresto del cazzo per passare tra la perfusione uno e la perfusione due forniture di soluzione al tessuto. E passare il cazzo di arresto alla perfusione in una posizione.
Quindi innescare il resto del set di tubi. Riempire completamente una trappola a bolle in linea per evitare l'introduzione di bolle d'aria nel tessuto. Successivamente, fare un'incisione trasversale pulita, perpendicolare alla circolazione epatica per rivelare sezioni trasversali dei rami delle vene portale e delle vene epatiche per la cateterizzazione.
E utilizzare un catetere aderente per cateterizzare le vene disponibili e esposte. Quando i cateteri sono in posizione, perfondere il tessuto epatico reinsediato con perfusione calda una soluzione a una portata di 100 millimetri al minuto. Spostare il tubo di uscita dalla vena alla vena ogni 30-60 secondi.
E usando un tubo di evacuazione per rimuovere il tampone in eccesso dal vassoio del tessuto. Dopo aver pedalando attraverso tutte le vene disponibili per 15-20 minuti, passare alla perfusione due soluzioni nelle stesse condizioni. Utilizzando una pompa di ritorno per riciclare la perfusione due soluzioni al serbatoio, a una portata più lenta, per la re-somministrazione nel tessuto.
Controllare la temperatura superficiale della trappola a bolle e, o il fegato circa ogni cinque minuti per confermare che gli epatociti non si raffreddore. Quando il fegato brilla dopo circa 30 minuti di perfusione, trasferire il tessuto in un contenitore sterile, avvolto con un drap sterile, e posizionare il contenitore in una cappa di coltura cellulare per mantenere la sterilità durante la lavorazione degli epatociti. L'isolamento della collagenasi degli epatociti e la dissociazione cellulare devono essere fatti completamente in modo da non avere un raggruppamento delle cellule che diminuisce la vitalità delle cellule e la frequenza di trasduzione.
Immergere il fegato con mezzo di lavaggio epatocita e trascinare le forbici sulla parte superiore del tessuto per interrompere la capsula del fegato. Indossando guanti sterili, massaggiare delicatamente il fegato per rilasciare gli epatociti nel mezzo. E filtrare il supernatante tissutale, attraverso una garza sterile, in bottiglie di centrifuga da 200 millilitri.
Raccogliere gli epatociti filtrati per centrifugazione. Mettere in comune le cellule in 150 millilitri di mezzo di lavaggio epatocita fresco in un'unica bottiglia da 200 millilitri per 2 lavaggi aggiuntivi. E contando le cellule dopo la terza centrifugazione.
Quindi, diluire le cellule a 1 per 10 al nono epatociti per concentrazione salina millilitro. Per l'autotrapianto degli epatociti isolati, utilizzare un trasduttore da due-cinque megahertz per identificare la vena del portale tramite ultrasuoni e dirigere un ago da cinque pollici e 18 gauge verso la vena del portale principale, approssimativamente alla sua biforcazione. Caricare le cellule in una siringa da 60 millilitri, in base al volume totale della cella e attaccare la siringa all'ago, facendo attenzione a non introdurre bolle.
Successivamente, deprimere lentamente lo stantuffo della siringa per infondere manualmente fino a 1 per 10 al nono epatociti attraverso la vena portale utilizzando un catetere per infusione per monitorare la pressione porale durante il trapianto. Una volta consegnate tutte le cellule, rimuovere il catetere e monitorare la vena porta per la presenza di eventi trombotici e il flusso in avanti tramite ultrasuoni. In una coorte rappresentativa di cinque suini, che è stata sottoposta a resezione epatica, la maggior parte aveva rese superiori al 10 al nono epatociti con circa l'80% di vitalità.
Fornire un numero sufficiente di cellule per qualsiasi tipo di manipolazione desiderata, compresa la terapia genica. La successiva coltura della porzione non trapiantata di questi epatociti preparati, ha dimostrato una buona vitalità e adesione con una tipica morfologia epatocitaria 46 ore dopo la loro trasduzione e placcatura iniziale. Un innesto iniziale varia in base al numero di cellule reintrodotta durante il trapianto.
Queste biopsie rappresentative dimostrano una linea temporale di espansione cellulare corretta dal gene. Unico per malattie, come la tirosinemia ereditaria di tipo 1, che godono di una pressione selezionata positiva per le cellule sane. Questa espansione è in genere completa 12 mesi dopo il trapianto.
Una volta che un animale knockout idrolasi fumarilacetato trapiantato ha raggiunto circa il 20% di re-popolazione degli epatociti corretti all'interno del fegato, i livelli di tirosina si normalizzeranno rispetto agli animali di tipo selvatico. Mentre gli animali non corretti mostrano un'elevazione significativa sia nella fosfatasi alcalina che nella transaminasi aspartata rispetto agli animali di tipo selvatico, la terapia genica ex vivo riporta questi livelli di enzimi sieri alla normalità. Inoltre, la salute metabolica generale del fegato viene interrotta nei suini knockout non trattati, come indicato dalle elevazioni nell'ammoniaca circolante che vengono corrette dopo la ripopolamento con gli epatociti trattati.
È importante ricordare con l'uso di questa tecnica per gestire e manipolare il tessuto con attenzione e il meno possibile. Una maggiore manipolazione o manipolazione del tessuto, porta a ridurre la vitalità delle cellule e diminuire la resa. Questo approccio può essere applicabile anche alle persone interessate a studiare la distribuzione dell'arco e le inefficienze dei grafici nelle tecniche di etichettatura, utilizzando altre tecniche al di fuori dei protocolli di trasduzione virale.
Non dimenticare che lavorare con vettori virali può essere pericoloso, quindi seguire procedure di biosicurezza adeguate, oltre a indossare dispositivi di protezione individuale è necessario quando si utilizzano queste tecniche.
