Gli autori ringraziano William Nance (Università del Michigan) per un aiuto nella formulazione dei protocolli di crescita biofilm e John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) per un parere su questioni tecnologiche relative al sistema Bioflux. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 di AHR) e University of Michigan fondi di start-up a AHR

Il protocollo di raccolta della saliva qui descritta è stata valutata da l&#39;Università del Michigan Institutional Review Board per soggetto umano di ricerca. NOTA: Per quanto riguarda le recensioni istituzionali per il lavoro umano soggetti di questo tipo, le modalità e le autorizzazioni precedenti dovrebbero essere raccolto dalla istituzione ospitante. In particolare, a seconda dell&#39;istituto, IRB o approvazione etica potrebbero aver bisogno di essere cercato e approvate prima raccolta di saliva da volontari umani può procedere. Come aiuto alla preparazione di una domanda, un utile NIH algoritmo / grafico può essere trovato qui: <a href="http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf">http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf</a> 1. Preparazione del pool saliva per l&#39;uso come mezzo di crescita per l&#39;ambiente Germane <ol><li> Reclutare&gt; 5 individui per saliva donazione. Non prendere alcuna informazione di identificazione, assicurarsi che non individuals donerà saliva se sono malati, o hanno preso antibiotici per via orale negli ultimi 3 mesi, o hanno consumato cibi o liquidi, con l&#39;eccezione delle acque, nel precedente 2 ore prima della donazione. </li><li> Raccogliere saliva in 50 ml provette di plastica. Pool la saliva raccolta in un becher di plastica, mantenendolo in ghiaccio. Non utilizzare vetro come polimeri nella saliva aderiscono alle superfici di vetro interne. </li><li> Aggiungi Ditiotreitolo (DTT) per una concentrazione finale di 2,5 mm da uno stock 100x. (Archivio è congelato in monouso aliquote a -20 ° C). Agitare per 10 minuti in un becher di plastica su ghiaccio. </li><li> Al fine di rimuovere il particolato, centrifugare la saliva aggregate per 30 min a 17.500 x g. </li><li> Diluire la saliva con 3 volumi di dH 2 O invia un quarto saliva concentrato. </li><li> Filtro-sterilizzare saliva con 0,22 micron polietersulfone (PES), basso contenuto proteico del filtro vincolante. Usare filtro con grande superficie, o utilizzare più piccoli filtri dell&#39;area. Tenere saliva in uncontenitore di plastica sul ghiaccio mentre filtraggio. </li><li> Congelare la saliva in pool a -80 &#160; ° C in provette di plastica 50 ml fino doveva crescere batteri. Ogni tubo di plastica è solo per uso e dovrebbe contenere non più di 35 ml in ciascun pozzetto microfluidica contiene un massimo di 1,2 ml (1,2 ml x 24 pozzetti = 28,8 ml) e lo spazio è necessaria in ciascuna provetta come saliva espande durante il congelamento. </li><li> Per l&#39;uso, scongelare la saliva pool a temperatura ambiente. Una volta scongelato, il filtro-sterilizzare una volta di più (0,22 micron polietersulfone, proteine ​​a basso filtro legame per rimuovere eventuali precipitati). </li></ol> 2. Preparazione del pool saliva per l&#39;uso come un inoculo <ol><li> Reclutare&gt; 5 individui per saliva donazione. Non prendere alcuna informazione di identificazione, non accertare individui donare saliva se sono malati, hanno preso antibiotici per via orale negli ultimi 3 mesi, o che hanno consumato cibi o liquidi, con l&#39;eccezione delle acque, nel precedente 2 ore prima della donazione. Raccogliere samples oltre 30 min. </li><li> Raccogliere saliva in provette di plastica da 50 ml a temperatura ambiente e in comune la saliva raccolta in un becher di plastica a temperatura ambiente. </li><li> Diluire saliva in pool con autoclave glicerolo grado Reattivo per produrre un titolo con un rapporto finale del 25% glicerolo, il 75% saliva cella contenente [CCS]. </li><li> Congelare saliva a -80 ° C in 3 ml monouso aliquote fino al momento. </li><li> Quando necessario per inoculare il sistema microfluidica, aliquote sono scongelati a temperatura ambiente e agitati delicatamente su un vortex per 5 secondi prima di essere pipettati nel sistema microfluidica come descritto al punto 3 del protocollo, di seguito. </li></ol> 3. La crescita di biofilm orali Multi-specie <ol><li> Pretrattamento CFS <ol><li> Prima mano i canali microfluidica Bioflux con CFS. Aggiungere 100 ml di CFS per ogni presa bene. Utilizzando il software di controllo Bioflux, selezionare &quot;Manuale&quot; e impostare il flusso dai canali tha &quot;B1-B24&quot;t devono essere utilizzati. </li><li> Successivamente, impostare taglio a 1,0 dyne / cm e avviare il flusso per 2 minuti a temperatura ambiente per assicurare una distribuzione omogenea dei CFS tutto il canale. Assicurarsi che sia fluido in ogni canale di ingresso per verificare che la CFS scorreva attraverso tutti i canali in modo uniforme. </li><li> Incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Rimuovere la soluzione / pretrattamenti CFS che rimane nei pozzetti di scarico e trasferire ai pozzi di ingresso. Questo volume totale di 100 microlitri servirà a bilanciare contro la pressione applicata alla inoculo dalla presa bene. </li></ol></li><li> Inoculazione <ol><li> Per ogni uscita bene, aggiungere 100 ml di CCS inoculo. Posizionare la piastra microfluidica sulla piastra termica (temperatura impostata a 37 ° C), selezionare manuale all&#39;interno del software di controllo, e al flusso di uscita dai pozzi ai pozzetti di ingresso (cioè, indietro) a 1,0 dyne / cm per esattamente 6 sec. </li><li> Incubare la piastra microfluidica a 37 ° C per 40 min per permettereper aderenza e la crescita dei batteri nel inoculo iniziale. </li></ol></li><li> Crescita Pernottamento <ol><li> Per i canali utilizzati inoculati, aspirare l&#39;inoculo rifiuti da ciascuno dei pozzetti di uscita. Aggiungere fino a 1 ml di volume totale di CFS in ciascuno dei pozzetti di aspirazione (può essere fatto in cima CFS esistente). </li><li> Incubare la piastra microfluidica a 37 ° C, selezionare manuale e impostare il programma per funzionare a 0,2 dyne / cm² per 20 ore. </li></ol></li><li> Stain prelavaggio <ol><li> Aspirare tutto il liquido dai pozzetti di ingresso e uscita e aggiungere 100 ml di PBS (pH 7.4) a ciascuno dei pozzetti di aspirazione. Flusso per 20 minuti a 0,2 dyne / cm². </li></ol></li><li> Stain Inoltre miscela <ol><li> Per la vitalità delle cellule colorazione fare 100 ml di miscela macchia per ogni canale da colorare. In particolare, aggiungere 3 ml di SYTO 9 e 3 ml di ioduro di propidio per ml di PBS utilizzando il kit di colorazione vitalità cellulare commerciale, come Live / Dead. Questo generauna miscela di colorazione contenente 10 mM SYTO 9 e 60 micron ioduro di propidio. </li><li> Aspirare il restante PBS dai pozzetti di aspirazione e quindi aggiungere 100 microlitri della miscela colorante vitalità cellulare a ciascun bocchettone. Impostare scorrere a 0,2 dyne / cm 2 ed eseguire la soluzione dall&#39;aspirazione alla mandata per 45 min a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavaggio post-colorazione <ol><li> Aspirare la macchia rimanente in ciascuno dei pozzetti di aspirazione e aggiungere 100 ml di soluzione salina in ogni ingresso bene. Situato a scorrere a 0,2 dyne / cm² ed eseguire la soluzione PBS da alla mandata per 20 minuti a temperatura ambiente per eliminare ogni macchia in eccesso. </li></ol></li></ol> 4. Immagine Collection, rendering 3D, e Image Analysis <ol><li> Utilizzare un microscopio a scansione laser confocale invertita (CLSM) per raccogliere i dati di immagine biofilm dal sistema microfluidica. Assicurarsi che il CLSM è in grado di sopportare il peso del piatto Bioflux, che può raggiungere i 150 g. NOTA: Data la monetinansions dei canali microfluidica, la necessità di sensibilità di discernere la struttura biofilm, ei requisiti per rilevare il segnale di fluorescenza di varia intensità, adattano il CLSM con un 40X 1,25 NA lente dell&#39;obiettivo o uno con qualità simile ottica, ingrandimento, e apertura numerica. </li><li> Standardizzare le porte di cattura delle emissioni di guadagno e di offset misurazioni mantenuti costanti. Assicurarsi che la potenza del laser non superi il 25% in quanto ciò può causare fotometabolismo. </li><li> Convertire i file CLSM dalla L EICA I Mage F tipo ile (LIF) a OME (O pen M icroscopy mbiente) tipo di file. Questo consente una maggiore facilità di accesso e compatibilità tra programmi software. Utilizzare il software disponibile in commercio come, Imaris per convertire i file di questo tipo. </li></ol> Rendering 3D per le immagini / Figure <ol start="4"><li> Una volta convertito in formato OME, utilizzare un software disponibile in commercio come Imaris rendere le immaginiin 3D. Eseguire questo utilizzando una combinazione di opzioni &quot;superare&quot; &quot;Easy3D&quot; e. NOTA: Attenzione al segnale di fondo e soglia dovrebbe essere fatto. La funzione istogramma in Imaris può essere utilizzato per ottenere la gamma di raccolta e questo deve essere mantenuta costante tra immagini analizzati. </li><li> Salvare le immagini utilizzando la funzione &quot;snapshot&quot; e fare un attento esame di risoluzione prima di salvare i tipi di file. </li><li> Montare immagini in figure utilizzando immagine software di editing, come CorelDraw o Adobe Illustrator. </li></ol> Image Analysis 3D per Grafici e tabelle <ol start="7"><li> Utilizzare liberamente disponibile ImageJ 23 e COMSTAT / COMSTAT2 38 per l&#39;analisi delle immagini. Scaricare i pacchetti da http://rsb.info.nih.gov/ij/ e http://comstat.dk/ rispettivamente. Avere l&#39;aggiornamento più recente di Java installato. NOTA: Il JAVA piattaforma software dovrà essere installato prior per l&#39;uso del software di analisi di immagine. <ol><li> Utilizzare il software ImageJ con COMSTAT2 plugin per importare i file OME per ogni immagine biofilm in modalità &quot;HyperStack&quot; e vista con &quot;canali SPLIT&quot;. </li><li> Analizzare singolarmente i due canali (rosso / propidio-ioduro / morti canale da 0, / DIRETTA essendo canale verde / SYTO-9 1) utilizzando la funzione &quot;istogramma&quot; di ImageJ. Questa funzione riporta il numero totale di pixel di file OME 8 bit (indicate come &quot;count&quot;) ad ogni intensità di colore da 0 a 255 (indicato come &quot;valore&quot;), con 0 essendo pixel con assenza di segnale (fondo) e 255 dell&#39;essere pixel con saturazione del segnale completo. </li><li> Esportare i dati in un foglio di calcolo e di standardizzare tutti i valori dei segnali ponderando ogni pixel per l&#39;intensità del segnale corrispondente. Questa operazione viene eseguita moltiplicando il numero totale ad una data intensità di segnale dal valore numerico 8 bit (0-255) di tale intensità di segnale. </li><li> Sommare tutti i valori ponderati, 0-255, per entrambi i canali per ogni immagine catturata biofilm. Prendere la somma dei valori ponderati per entrambi i canali di determinare il segnale totale cento da uno dei due canali. Fate questo per determinare il relativo rapporto o cento rosso e il segnale verde per cento (vale a dire la percentuale di &quot;morto&quot; e cento &quot;LIVE&quot; per ogni trattamento). </li><li> Effettuare analisi statistiche, per esempio con due code T-test di Student modificato per varianza disuguale. Valori di p &lt;0,05 sono considerati significativi e quei valori di p &lt;0,01 sono considerati altamente significativo. </li></ol></li></ol> 5. La raccolta Biofilm Cells per l&#39;analisi Cultura-indipendente <ol start="1"><li> Rimuovere tutti saliva esaurito e inutilizzato da ingresso e di uscita pozzi. Lavare i pozzetti con 1 ml di acqua distillata sterile tre volte. </li><li> Aggiungere 100 ml di acqua distillata sterile per i pozzi di ingresso e, utilizzando l&#39;interfaccia di controllo del software, passare ilacqua distillata sterile in avanti attraverso i canali a&gt; 8,0 dyne / cm 2 (portata&gt; 745 ml / h, al taglio di 800 sec -1) per almeno 5 minuti. Ripetere in senso inverso per almeno 5 minuti e poi ripetere il processo in avanti e indietro fase di lavaggio. </li><li> Controllare dalla luce o al microscopio a epifluorescenza (se sono state colorate cellule / etichettato) per la rimozione biofilm spinto (Figura 2). Raccogliere il 100 microlitri di cellule-sospensioni e conservare a -80 ° C per l&#39;analisi della cultura indipendente. Un&#39;analisi economica di composizione della comunità può essere raggiunto attraverso l&#39;utilizzo di batteri tag con codifica FLX amplicone pyrosequencing (bTEFAP) utilizzando l&#39;approccio descritto in Nance et al. 20 </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+bacterial+infections+through+culture-independent+approaches.">Studying bacterial infections through culture-independent approaches.</a> Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).</li><li>Socransky, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+of+the+gingival+crevice+area+of+man.+I.+Total+microscopic+and+viable+counts+and+counts+of+specific+organisms.">The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms.</a> Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).</li><li>Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+adherence+and+colonization.+Microbiology+and+molecular+biology+reviews).">Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews).</a> MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).</li><li>Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+spatial+distribution+of+viable+and+nonviable+bacteria+in+hydrated+microcosm+dental+plaques+by+viability+profiling.">Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling.</a> Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).</li><li>Adams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+laboratory+model+to+assess+the+removal+of+biofilm+from+interproximal+spaces+by+powered+tooth+brushing.">Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing.</a> American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).</li><li>Ledder, R. G., McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+comparison+of+dentifrice+formulations+in+three+distinct+oral+microbiotas.">An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas.</a> Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).</li></ol>

A. H. R. and N.S.J. have received research awards from a variety of sources such as the National Institutes of Health (NIDCR), Colgate-Palmolive (Piscataway, NJ) and the Society for Applied Microbiology to fund research studies in their lab over the past five years. All other authors: none to declare.

Questo documento mette in evidenza i metodi i passaggi di base necessari per configurare e gestire un sistema di microfluidica in modo da consentire lo sviluppo di biofilm orali multi-specie derivati ​​da pool saliva umana e coltivate in sterilizzata per filtrazione 25% pool saliva umana. Approcci per caratterizzare il biofilm sono date ma va ricordato che questi approcci descritti sono modificabili e tecnologie aggiuntive come, ad esempio, macchie o etichette possono essere introdotti. È un dato di esempio, si pot...

<html> I biofilm sono architettonicamente comunità complesse di batteri che sono raggruppati sulle superfici 1. Queste comunità in genere contengono numerose specie che interagiscono tra loro all&#39;interno del biofilm 2. Biofilm orali, il più visivamente evidente essendo la placca dentale, sono un problema persistente negli esseri umani e dei loro risultati di sviluppo incontrollato della generazione di tassonomicamente diverse comunità multi-specie 3. I batteri che compongono queste diverse comunità possono essere fino a 1.000 volte più resistenti agli antibiotici rispetto ai loro (planctonici) controparti free-floating 4-6. Il mancato trattamento di queste comunità biofilm orali, che possono causare carie e malattia parodontale, ha portato ad un notevole onere di salute pubblica: oltre 500 milioni di visite dal dentista all&#39;anno negli Stati Uniti, e uno di circa 108.000 milioni dollari per trattare o prevenire parodontale malattia e carie dentale 7. content &quot;&gt;&quot; Mentre molti microbiologi sostengono lo studio del comportamento microbica in condizioni naturali, alcuni di loro lo fanno. Questo perché la loro morale per superare le difficoltà è costantemente minato dalla facilità attraente di lavorare con culture di laboratorio. &quot;-Smith 8. Allo stato attuale, la ricerca biofilm orale è condotta utilizzando una varietà di in vivo e in vitro approcci, ognuno con i propri vantaggi e svantaggi 9,10. In vitro avvicina spesso utilizzano sistemi biofilm modello che sono relativamente facili da impostare, ma possono mancare clinico / rilevanza nel mondo reale 10,11. In vivo approcci fanno affidamento sui sistemi modello animale che possono riprodurre alcuni aspetti dell&#39;ambiente orale umana, ma ancora una volta soffrire di limitazioni dovute a differenze di anatomia, fisiologia, microbiologia e immunologia tra animali ed esseri umani 12, 13. Va notato che biofilm oralipuò anche essere sviluppato su superfici smaltate detenuti in uno stent all&#39;interno delle bocche di volontari umani, ma questo approccio è attualmente relativamente costoso e 14,15 alta intensità di manodopera. In ultima analisi, nuovi agenti o tecnologie per migliorare l&#39;assistenza sanitaria per via orale sono testati sugli esseri umani in condizioni di studi clinici controllati 11. Allo stato attuale, un modus operandi spesso utilizzato per identificare e valutare nuovi agenti sanitari orali è quello di eseguire studi di laboratorio prima di discernere potenziale efficacia, e quindi eseguire studi sugli animali e le &quot;prove sul campo&quot;, che utilizzano i medici per valutare il successo della tecnologia 9, 16,17. Purtroppo, studi di laboratorio tendono a fare affidamento su sistemi modello che occupano una grande impronta, sono tecnologicamente difficile da usare, e spesso contengono semplificati comunità di uno o al massimo un paio di specie di trarre il potenziale del mondo reale che significa 10,18. Dato che biofilm di placca dentale contengono più specie e forma in un complex scorre ambiente salivare, sviluppando biofilm che contengono una o poche specie mezzi artificiale è improbabile generare comunità che si comportano in modo simile a quelle di un scenario reale 10,19. Per affrontare il tempo, costi, requisiti di formazione, e la rappresentatività dei poveri sistemi biofilm modelli di laboratorio rispetto per l&#39;ambiente del mondo reale, abbiamo recentemente sviluppato un elevato throughput e di biofilm germano ambientale 20 (Figura 1). I vantaggi del sistema l&#39;uso di pool saliva umana cell-free (CFS) come mezzo e non trattata pool saliva cellule contenenti batterica umana (CCS) come inoculo. Unicamente, il sistema combina la tecnologia microfluidica, un microscopio confocale a scansione laser, e la diversità batterica tecnologia cultura indipendente di analisi. Così, il sistema modello è attinente ambientale (utilizzando la saliva come inoculo di crescere biofilm multispecie a 37 ° C in sterilizzata per filtrazione, che scorresaliva) e biofilm orali contengono specie (tra cui Streptococcus, Neisseria, Veillonella, e specie Porphyromonas) in abbondanze rappresentante di quelle che si trovano nei primi mesi della placca sopragengivale 20. Quando si considera che questo lavoro descrive l&#39;utilizzo del modello di sistema di nuova concezione, particolare attenzione deve essere data alla fusione di un microscopio a scansione laser confocale (CLSM) microfluidica, e le tecnologie della cultura indipendente di analisi diversità. L&#39;unione di queste tecnologie da parte del nostro gruppo di ricerca è stato intenzionale e non solo aggiunge una capacità high-throughput per il sistema modello di nuova concezione, ma permette anche domande da porre che non potrebbero essere facilmente affrontati prima che con altri sistemi. In primo luogo, CLSM presenta evidenti vantaggi rispetto microscopia tradizionale in quanto consente l&#39;analisi tridimensionale di biofilm. Spesso incompreso, questo è estremamente importante in quanto biofilm sono wit eterogeneih rispetto alla composizione delle specie e posizione spaziale e le condizioni fisiologiche imposti in differenti posizioni spaziali all&#39;interno del biofilm 6,21. In concerto con software tridimensionale di rendering e immagini software di analisi, l&#39;architettura biofilm, relazioni spaziali tra le specie che lo compongono, e l&#39;estensione della soppressione antimicrobica possono essere analizzati 22-24. Tali capacità non sono possibili utilizzando standard di luce trasmessa o epifluorescenza. Successivamente, microfluidica ha raccolto un&#39;attenzione particolare nel campo della microbiologia quanto consente lo studio di biofilm in condizioni attentamente controllate (portata, temperatura, pH, ecc) e richiede solo piccoli volumi di liquido 25-27. Come punto di confronto, in crescita di biofilm orale nella saliva umana all&#39;interno di un sistema modello cella di flusso (un sistema che è probabilmente considerato il modello di pilastro per molti studi biofilm orale) per 20 ore ad una simile portata e taglio conseguito,in un sistema microfluidico richiede almeno 200 ml, rispetto a 800 microlitri nel dispositivo microfluidico 28-31. Così, un sistema modello biofilm microfluidico consente lo studio di materiale quantità limitata determinate condizioni. Infine, la tecnologia pirosequenziamento è stata ottimizzata nell&#39;ultimo decennio richiedere solo piccole quantità di materiale di eseguire un&#39;analisi comunità ed è sufficientemente versatile per controllare la profondità di sequenziamento per ottenere l&#39;identità di specie biofilm anche rare. L&#39;uso di questa tecnologia, come ad esempio batteri tag con codifica FLX amplicone pyrosequencing (bTEFAP), ha consentito di domande pertinenti riguardanti l&#39;ecologia di biofilm da affrontare 32,33. Queste domande imbevuti difficoltà in passato, quando pirosequenziamento non era disponibile a causa del tempo e dei costi necessari per creare librerie plasmidi e le misure tecnologiche e analitici complessi necessari per ricavare dati 33,34. Naturalmente, un grande vantaggio di cultura indipendente apapprocci, come pirosequenziamento, è che le specie batteriche che non possono essere coltivate isolatamente entro supporti laboratorio convenzionali (specie cioè vitali ma non coltivabili) possono essere coltivate ed identificati nel sistema modello e loro abbondanza relativa nella comunità quantificati 35, 36 . Per aggiungere prospettiva, già nel 1963 il ritardo Sigmund Socransky stima che circa il 50% dei batteri in materiale isolato dal gengivale orale umana non potrebbe essere coltivato utilizzando condizioni di crescita di laboratorio 37. L&#39;obiettivo di questo lavoro è quello di metodi descrivere l&#39;approccio per sviluppare orale biofilm multi-specie in un sistema disponibile in commercio microfluidica (Bioflux) in: (i) condizioni rappresentative della cavità orale umana e (ii) con una composizione e abbondanza delle specie che è paragonabile alla placca sopragengivale. Inoltre, utilizzando sia software freeware e commerciali, si evidenzia come biofilm di basemisure architettura possono essere derivate da dati CLSM, con un focus sugli approcci per quantificare biofilm biomassa, rugosità, e la vitalità (basati su Live / colorazione Morto). Infine, sono descritti i passaggi necessari per raccogliere materiale biofilm per l&#39;analisi della diversità, bTEFAP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="951">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:525px;">SUPPLIES AND EQUIPMENT</td>
			<td style="width:224px;">AVAILABLE FROM COMPANY</td>
			<td style="width:203px;">CATALOG NUMBER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorval ultracentrifuge&#160; (SS-34 compatible)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Unit-dependent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific SS-34 Rotor&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>28-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific Inc</td>
			<td>23-290-065</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>73520-986&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>NC0542269</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioFlux microfluidic system</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>Bioflux 200 system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux 24-channel plate</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>910-0004</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>10010023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIVE/DEAD stain (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SPE or eqivalent system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrosequencing facilities</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Decon SaniHol 70 Ethanol Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Ultra Low Temperature Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips (20, 200, and 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux dedicated software</td>
			<td>Bioflux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica SPE</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COMSTAT/COMSTAT 2</td>
			<td colspan="2">Freeware (http://www.comstat.dk/)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms

Ci sono pochi-throughput elevato in sistemi in vitro che facilitano lo sviluppo di biofilm multispecie che contengono numerose specie comunemente rilevati all&#39;interno di biofilm orali in vivo. Inoltre, un sistema che utilizza saliva umana naturale come fonte di nutrienti, invece di mezzi artificiali, è particolarmente auspicabile per sostenere l&#39;espressione di proprietà cellulari e specifici biofilm che imitano le comunità in vivo. Noi descriviamo un metodo per lo sviluppo di multispecie biofilm orali che sono paragonabili, rispetto alla composizione delle specie, per sopragengivale placca dentale, in condizioni analoghe a cavità orale umana. In particolare, questo articolo metodi descriverà come un sistema microfluidico disponibile in commercio può essere adattato per facilitare lo sviluppo di multispecie biofilm orali derivate da e coltivata all&#39;interno saliva pool. Inoltre, una descrizione di come il sistema può essere utilizzato in congiunzione con un confocalaser microscopio a scansione l per generare 3-D ricostruzioni biofilm per analisi di architettura e vitalità saranno presentati. Data la grande diversità dei microrganismi che si sviluppano all&#39;interno di biofilm nel sistema microfluidica (compreso Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, e Porphyromonas), un protocollo verrà presentato anche che descrive come raccogliere le cellule biofilm per ulteriori subcultura o l&#39;estrazione del DNA e l&#39;analisi. Verranno trattati i limiti sia del sistema biofilm microfluidica e le analisi attuali state-of-the-art di dati. In ultima analisi, è previsto che tale articolo fornisce una tecnica di base in grado di migliorare lo studio dei biofilm orali e contribuire allo sviluppo di tecnologie aggiuntive che possono essere integrate con la piattaforma microfluidica.

Rendering 3D di biofilm Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 3. Uno strumento utile nel software Imaris è la possibilità di esaminare ogni fetta di stack biofilm raccolta e combinarli per creare ricostruzioni tridimensionali. Inoltre, gli effetti shadowing artificiali possono essere aggiunti per aiutare visivamente interpretare strutture tridimensionali. I biofilm resi possono essere orientati in qualsiasi direzione con diversi ingran...

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Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

L&#39;obiettivo di questo metodo è di descrivere l&#39;uso di un sistema microfluidico per lo sviluppo del biofilm multispecie che contengono specie tipicamente identificate nella placca dentale sopragengivale umana. Metodi per descrivere l&#39;architettura biofilm, la vitalità biofilm, e un approccio alla raccolta biofilm per le analisi di coltura-dipendente o indipendente dalla cultura sono evidenziati.

L&#39;uso di un high-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic sistema per sviluppare orale biofilm Multi-specie

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

use-high-throughput-vitro-microfluidic-system-to-develop-oral-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

13.4K Views.  The University of Michigan.  L'obiettivo di questo metodo è di descrivere l'uso di un sistema microfluidico per lo sviluppo del biofilm multispecie che contengono specie tipicamente identificate nella placca dentale sopragengivale umana. Metodi per descrivere l'architettura biofilm, la vitalità biofilm, e un approccio alla raccolta biofilm per le analisi di coltura-dipendente o indipendente dalla cultura sono evidenziati. 

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Ricerca

Bioingegneria

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

High Throughput Microfluidic rapido ed economico prototipazione metodi a basso Packaging

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Analisi sistematica delle<em&gt; In Vitro</em&gt; Cella rotolamento Utilizzando un piatto multi-ben Sistema Microfluidic

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or lethality. However, the probability of a synthetic small molecule being bioactive is low; therefore, thousands of molecules must be tested in order to find those of interest. Liquid handling robotics systems are designed to handle large numbers of samples, increasing the speed with which a chemical library can be screened in addition to minimizing/standardizing error. To achieve a high-throughput forward chemical genetics screen of a library of 50,000 small molecules on Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocols using a bench-top multichannel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement. With these protocols, 3,271 small molecules were discovered that caused visible phenotypic alterations. 1,563 compounds induced short roots, 1,148 compounds altered coloration, 383 compounds caused root hair and other, non-categorized, alterations, and 177 compounds inhibited germination.

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A high throughput screen of synthetic small molecules was conducted on the model plant species, Arabidopsis thaliana. This protocol, developed for a liquid handling robot, increases the speed of forward chemical genetics screens, accelerating the discovery of novel small molecules affecting plant physiology.

Ottimizzare l'utilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

Identificazione ad alto contenuto di velocità effettiva della resistenza a Pseudomonas syringae pv. Pomodoro nel pomodoro utilizzando Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...