Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione proteica, ad esempio se la proteina si lega direttamente a una molecola piccola o grande. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un modo semplice e veloce per rilevare le interazioni dirette a livello atomico. Accendere il flusso d'aria con il comando di espulsione ej.
Questo porterà il campione dal magnete. Ora, posizionare il campione all'interno di uno spinner sopra il magnete nell'apertura. Inserire con il comando ij.
Attendere che il campione si stabilizza all'interno del magnete prima di procedere. Creare un nuovo set di dati utilizzando il comando edc e caricare i parametri NMR proton standard selezionando l'esperimento ZGPR. Compilare i campi NOME, numero dell'esperimento e numero di cartella dati elaborati.
Selezionate il solvente nel campo Imposta solvente (Set solvent) e fate clic su Esegui getprosol per leggere i parametri standard dipendenti da probehead e solvent. Bloccare il campione sul solvente deuterato utilizzando il comando lock e attendere che sia terminato di spazzare e ottenere il blocco. Correggere la frequenza di risonanza del magnete sintonizzando il campione utilizzando il comando di sintonizzazione automatica atma.
Monitora la curva di oscillazione fino al completamento dell'accordatura automatica. Shim il campo magnetico usando topshim. Lo shimming si regola al campo magnetico.
Ottenere uniformità intorno al campione. È buona pratica archiviarlo in valori con il comando wsh e leggerli usando rsh prima di topshim, se si utilizzano campioni uguali o simili. Ora regola il guadagno del ricevitore con il comando rga per ottenere il massimo rapporto segnale/rumore.
Posizionare il centro dello spettro sull'offset di risonanza dell'acqua e impostare l'impulso protonico di 90 gradi ad alta potenza utilizzando calibo1p1. Raccogli lo spettro protonico usando il comando e il processo zero go zg con efp. Ciò include la moltiplicazione esponenziale, il decadimento a induzione libera che incorpora l'allargamento della linea, la trasformazione di Fourier della FID e la pk per applicare la correzione di fase.
Applicare l'apk di correzione automatica della fase e l'assale di correzione automatica della linea di base utilizzando l'opzione polinomiale senza integrazione. Creare un nuovo set di dati per l'esperimento SOFAST HMBC selezionando SFHMQC3GPPH nell'esperimento. Copiare il P1 e l'O1 ottimizzati dallo spettro protonico e popolare gli impulsi dipendenti P1 usando il comando getprosol 1H p1 plw1, dove p1 è il valore P1 ottimizzato, e plw1 è il livello di potenza per P1. Ora, ottimizza la costante CNST54 per impostare l'offset per lo spostamento chimico dell'ammide.
Ottimizzare anche CNST55 per definire la larghezza di banda al fine di comprendere le regioni spettrali di interesse, consentendo di ottimizzare il guadagno del ricevitore. Per selezionare questi parametri, estrarre il primo FID dallo spettro bidimensionale e cercare il segnale osservato per definirli. Inoltre, variare il ritardo di rilassamento, il numero di scansioni e le scansioni fittizie per ottenere una sensibilità del segnale accettabile con i comandi gs, che consente di andare e scansionare per monitorare la qualità dei dati in tempo reale.
Infine, registrare gli spettri usando Zero Go zg. Impostate i parametri di elaborazione sulla dimensione delle dimensioni F2 diretta e F1 indiretta dello spettro, con previsione lineare opzionale nella dimensione indiretta. Selezionate QSINE come funzione Finestra (Window) e immettete uno spostamento a campana seno di due per elaborare lo spettro bidimensionale.
Immettete il comando xfb per elaborare i dati in entrambe le direzioni con funzione finestra e trasformazione di Fourier. Utilizzare il comando apk2d per eseguire la correzione automatica della fase in entrambe le direzioni. Correggere la linea di base con la funzione di correzione automatica della linea di base abs2 per i dati 2D.
Questo applica una funzione polinomiale tra i valori ppm definiti nei parametri di elaborazione e produrrà uno spettro 2D per ulteriori analisi. Se si prevede di eseguire l'elaborazione seriale per il confronto dei dati di interazione con un'altra molecola, memorizzare i parametri di elaborazione con il comando wpar e richiamarli con rpar. Immettere il comando pp per iniziare il processo di prelievo di picco.
Definire l'intervallo ppm, l'intensità minima e il numero massimo di picchi in base ai picchi previsti. Quindi fare clic su OK. Verificare i risultati mediante ispezione visiva. Se necessario, eseguire di nuovo il processo fino a quando i risultati non sono soddisfacenti in base alla qualità degli spettri.
Generare un elenco di picco con il comando pp. Questo elenco di picco contiene informazioni sull'altezza dei dati e sull'intensità del picco per impostazione predefinita. L'elenco di picco può essere esportato negli spettro successivi e può essere letto da altri programmi.
Ora osservate gli spettri HSQC proteici per i cambiamenti nelle intensità di picco o il movimento nei cambiamenti chimici che indicano l'interazione con un'altra molecola. Se la molecola interagente è grande, aspettatevi riduzioni delle intensità di picco insieme alla scomparsa di alcuni picchi. Importare l'elenco di picco nel set di dati successivo facendo clic sulla scheda picchi e selezionando Importa con un clic con il pulsante destro del mouse nella finestra picchi.
Visualizza i picchi sullo spettro e, se necessario, spostali in nuove posizioni. Fare clic sulle intensità di ripristino per la tabella completa per generare un elenco di picco per lo spettro che include intensità. Questo elenco di picco riporterà le informazioni sulla posizione dall'elenco di picco memorizzato.
Esportare gli elenchi di picco da set di dati diversi in un foglio di calcolo o in un altro programma matematico per l'analisi selezionando la funzione Esporta. Calcola la variazione delle intensità di picco con l'intensità del picco della funzione nello spettro complesso, l'intensità di picco nello spettro proteico per ogni picco. I valori possono essere convertiti in variazione percentuale per moltiplicazione per 100.
Si noti che anche i volumi di picco sono utili, anche se le intensità di picco sono più facili da misurare per i picchi posizionati uno vicino all'altro, come di solito accade per le proteine con un'alta densità di picchi relativamente ampi. Gli N15HSQC sono stati acquisiti per il tipo selvaggio E-PRD, così come il mutante R1914E, in presenza o assenza di VimRod. Lo spettro del tipo selvaggio E-PRD mostra il numero previsto di picchi ben risolti, indicativo di una proteina correttamente piegata.
In presenza di VimRod, lo spettro mostra un ampio allargamento della linea e la massima scomparsa, corrispondente all'associazione tra E-PRD e VimRod. Poco cambiamento si osserva tra lo spettro del mutante R1914E da solo e l'aggiunta di VimRod, indicando una mancanza di legame con questo mutante E-PRD. Qui le intensità di picco E-PRD in presenza e assenza di VimRod sono state confrontate e tracciate come intensità di picco relative per indicare la gamma di picco che si allarga nel complesso E-PRD.
Per convalidare e quantificare il legame di VimRod ed E-PRD, l'analisi MST utilizzando His6-VimRod etichettato con colorante FLUORESCENTE RED-tris-NTA come bersaglio, è stata eseguita utilizzando concentrazioni decrescenti del ligando E-PRD. I dati erano adatti a un modello standard di legatura del ligando a un sito e davano un KD di 25,7 più o meno 2,1 micromolare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare condizioni di acquisizione ed elaborazione identiche.
avrà difficoltà a causa dell'accesso a campioni proteici etichettati isotopici per la raccolta di spettri NMR. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia del cancro, dell'infezione o delle malattie neurodegenerative perché comportano la formazione di interazioni proteiche compromesse nella malattia.
