Questo protocollo può essere utilizzato per il rilevamento e la caratterizzazione di dinamiche conformazionali proteiche, che sono essenziali per comprendere una grande varietà di processi cellulari. Rispetto ad altri metodi, questo metodo non richiede fasi specializzate di preparazione del campione e fornisce una caratterizzazione completa della cinetica, della termodinamica e degli aspetti strutturali dell'equilibrio confermazionale. La dispersione di rilassamento cpmg può essere applicata più ampiamente per la caratterizzazione della dinamica di conferma negli acidi nucleici e in altre biomolecole, così come per la caratterizzazione delle interazioni con le nanoparticelle ligandi.
Il nostro protocollo è rivolto agli utenti CPMG per la prima volta. Si tratta quindi di un buon punto di partenza. Tuttavia, ci aspettiamo che gli utenti conoscano i passaggi di base per l'esecuzione di esperimenti NMR convenzionali.
Per configurare un esperimento NMR per la prima volta, scaricare e decomprimere questi file supplementari. Copiare i bit. vv e trosy_15N_CPMG.
vv nella cartella del programma pulse nella directory del programma pulse. Aprire il software di acquisizione e utilizzare il comando EDC per copiare un esperimento HSQC a azoto idrogeno 15 eseguito in precedenza in un nuovo esperimento. Utilizzare il comando del programma pulse per caricare il trosy_15N_CPMG.
vv pulse nell'esperimento appena creato. Quindi utilizzare le istruzioni dalla fine del file del programma pulse per impostare l'esperimento CPMG. Per impostare un esperimento NMR di routine, introdurre il campione al magnete ed eseguire tutte le fasi di acquisizione nmr di base.
Impostare P1 sulla durata degli impulsi duri a 90 gradi di idrogeno e P7 sulla durata degli impulsi a azoto 15 duri a 90 gradi. Nella finestra di acquisizione, impostare la larghezza centrale e spettrale per le dimensioni idrogeno e azoto 15. Impostare il ritardo di rilassamento su 0,7 T2 e utilizzare il comando elenco VC per creare un elenco di numeri interi corrispondenti a N.Dopo aver confermato che ogni voce nell'elenco corrisponde a un campo CPMG diverso in base a CPMG archiviato è uguale a 4N diviso per D30, verificare che il primo numero nell'elenco sia zero.
Impostare L8 sul numero di voci nell'elenco VC, L3 sul numero di punti reali per la dimensione indiretta e 1TD su L8 per L3 per due. Per ottimizzare la soppressione dell'acqua, impostare il guadagno del ricevitore su uno e digitare EDC pull per aprire il file del programma di impulsi. Sulla riga 91 rimuovere i punti e virgola precedenti al goto 999 e salvare il file.
Utilizzando il comando GS, regolare i parametri SPDB0 per ridurre al minimo l'intensità del segnale FID. Quando l'intensità del segnale è stata modificata, reintrodurre un punto e virgola alla riga 91 del file del programma di impulsi e salvare il file. Per ottimizzare SPDB11, impostare il guadagno del ricevitore su uno e il tipo EDC pull per aprire il file del programma pulse.
Sulla riga 168 rimuovere i punti e virgola precedenti al goto 999 e salvare il file. Utilizzando il comando GS, regolare i parametri SPDB11 per ridurre al minimo l'intensità del segnale FID. Quando l'intensità del segnale è stata modificata, reintrodurre i punti e virgola alla linea 168 e salvare il file.
Per ottimizzare SPDB2, impostare il guadagno del ricevitore su uno e immettere EDC pull per aprire il file del programma pulse. Sulla riga 179 rimuovere i punti e virgola precedenti al goto 999 e salvare il file. Utilizzando il comando GS, regolare i parametri SPDB2 per ridurre al minimo l'intensità del segnale FID.
Quando l'intensità del segnale è stata modificata, re-introdurre i punti e virgola alla riga 179 del file del programma di impulsi e salvare il file. Per ottimizzare PLDB2, impostare il guadagno del ricevitore su uno e immettere EDC pull per aprire il file del programma pulse. Sulla riga 184 rimuovere i punti e virgola precedenti il goto 999 e salvare il file.
Utilizzando il comando GS, regolare i parametri PLDB2 per ridurre al minimo l'intensità del segnale FID. Quando l'intensità del segnale è stata modificata, reintrodurre i punti e virgola alla riga 184 del file del programma di impulsi e salvare il file. Eseguire il comando RGA per ottimizzare il guadagno del ricevitore.
Quindi eseguire il comando ZG per avviare l'esperimento. In questa figura, si possono osservare i risultati dei profili di dispersione del rilassamento acquisiti per ogni picco nello spettro dell'azoto idrogeno 15 Trosy. Dai profili di dispersione del rilassamento acquisiti, è possibile stimare il contributo di scambio al rilassamento trasversale dell'azoto 15 di ogni gruppo AMI dorsale.
Tracciando il rilassamento trasversale sulla struttura 3D della proteina in esame è possibile identificare le regioni strutturali in fase di scambio confermazionale sulla scala temporale del microsecondo millisecondo. La modellazione delle curve di dispersione di rilassamento usando le equazioni di Carver-Richards restituisce i parametri termodinamici e cinetici sul processo di scambio, come le popolazioni frazionarie degli stati in equilibrio e il tasso di cambio tra questi stati. La dipendenza dalla temperatura di questi parametri termodinamici e cinetici può quindi essere modellata usando rispettivamente le equazioni van't Hoff e I-ring per ottenere informazioni dettagliate sugli energetici dello scambio confermazionale.
È fondamentale ottimizzare attentamente tutti i parametri di acquisizione, in particolare P7. È anche importante produrre campioni altamente puri e omogenei per evitare dispersioni spurie. I parametri cinetici, termodinamici e chimici dei chip ottenuti utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per ricavare informazioni energetiche e strutturali sulle specie sottoposte allo scambio confermazionale. La caratterizzazione della dinamica di conferma proteica ottenuta con i metodi CPMG fornisce informazioni cruciali per comprendere la segnalazione e l'attività enzimatica, nonché nuove prospettive per la progettazione dei farmaci.
