La tecnica di potenziamento del rilassamento paramagnetico può essere utilizzata per caratterizzare e misurare le distanze intermolecolari e quantificare interazioni biomolecolari transitorie e/o scarsamente popolate. Qui, abbiamo applicato questa tecnica per catturare le interazioni che precedono la condensazione delle proteine. La sensibilità dei PRE consente l'identificazione della risoluzione atomica, il rilevamento e la quantificazione di stati dinamici che rimangono invisibili e inaccessibili ad altre tecniche NMR.
I passaggi chiave di questo protocollo includono la rimozione dell'etichetta di spin nitroxide non coniugato e l'analisi attenta degli spettri per misurare con precisione l'altezza del picco. Inoltre, è necessario prestare attenzione durante la configurazione dell'esperimento NMR e la calibrazione degli impulsi. Per iniziare, aggiungere 3-maleimido-PROXYL da una soluzione madre a 20 volte l'eccesso molare della proteina di interesse marcata isotopicamente 15N.
Incubare durante la notte a temperatura ambiente o quattro gradi Celsius al riparo dalla luce e dall'ossigeno e con un leggero dondolio o nutazione. Il giorno seguente, rimuovere l'etichetta di centrifuga libera non reagita per evitare che il solvente non specifico PRE utilizzi una dialisi estesa del campione proteico o la filtrazione su gel. Quindi utilizzare il reagente di Ellman per quantificare i gruppi sulfidrilici liberi nella soluzione.
Misurare l'assorbanza utilizzando un lettore di micropiastre e costruire la curva standard. Per misurare la PRE intramolecolare, preparare una proteina marcata con spin arricchita isotopicamente 15N ad una concentrazione di almeno 100 micromolari, ma non superiore a 300 micromolari, in un tampone adatto per la NMR. Quindi, utilizzando una pipetta di vetro a gambo lungo o una micropipetta, trasferire il campione NMR in un tubo NMR da cinque millimetri appropriato per l'uso in magneti ad alto campo.
Posizionare il campione nel magnete. Blocca il segnale del deuterio usando il comando di blocco e sintonizza e abbina il canale protonico secondo i protocolli della struttura. Quindi regolare gli spessori utilizzando la subroutine di spessore superiore per ottimizzare la soppressione del segnale del solvente.
Quindi, calibrare l'impulso protonico utilizzando il programma P-OPT. Quindi calibrare l'impulso 15N rispetto a un campione standard. Determinare l'attenuazione corretta per gli impulsi sagomati utilizzando la subroutine dello strumento forma.
Quindi aprire il file di forma a impulsi appropriato facendo clic sull'icona della cartella. Gli impulsi sagomati si trovano nella sezione dei parametri di impulso dei parametri di acquisizione. Dopo aver caricato il file di definizione dell'impulso, fare clic su Analizza forma d'onda, quindi su Integra forma.
Immettere l'impulso duro di 90 gradi del protone calibrato, la lunghezza dell'impulso di forma desiderata e la rotazione. Quindi calcolare il livello di potenza dell'impulso sagomato aggiungendo la variazione del livello di potenza all'attenuazione per l'impulso calibrato di 90 gradi. Registrare un protone 15N HSQC standard per ottimizzare la larghezza di sweep, la frequenza portante e controllare la soppressione dell'acqua.
Infine, regolate la larghezza della sweep e il numero di incrementi di quota indiretti utilizzando i comandi SW e TD o direttamente nelle finestre di dialogo appropriate. Calibrare gli impulsi sagomati come dimostrato in precedenza. Quindi immettere le lunghezze di impulso calibrate nella sezione dei parametri di impulso della scheda Parametri di acquisizione.
Per misurare il protone ammidico T2 utilizzando l'approccio a due punti di ritardo temporale, impostare i ritardi temporali modificando il file di elenco VD. Il primo ritardo è impostato su 0,01 millisecondi. Utilizzando la relazione con il PER massimo previsto, scegliere il secondo ritardo.
Quindi determinare un valore adatto confrontando i primi incrementi del primo e del secondo spettro di ritardo e regolando il secondo ritardo in modo tale che il segnale decada tra il 40 e il 50% del suo valore iniziale. Determinare il numero di punti complessi da registrare e il numero di scansioni per una media del segnale sufficiente. Quindi utilizzare il comando EXPT per calcolare il tempo dell'esperimento e avviare l'esperimento con il comando ZG. Dopo aver sciolto l'ascorbato di sodio nel tampone NMR, regolare il pH in modo che corrisponda a quello del tampone NMR originale.
Quindi aggiungere l'acido ascorbico al tubo NMR con un eccesso molare di 10 volte superiore alla concentrazione dell'etichetta di spin posizionando una goccia sotto il bordo del tubo. Tappare il tubo e capovolgere con attenzione per mescolare. Centrifugare a 200-400 G per 10-20 secondi in una centrifuga a manovella per depositare il campione sul fondo del tubo.
Dopo aver avvolto il tubo in un foglio, lasciare che la reazione proceda per almeno tre ore. Quindi registrare il protone ammidico T2 sul campione diamagnetico utilizzando gli stessi parametri utilizzati per il campione paramagnetico. I PRE di protoni gamma ammidici intramolecolari sono stati registrati su un frammento intrinsecamente disordinato auto-associante derivato dal dominio a bassa complessità della proteina legante l'RNA EWSR1.
Si prevede che i residui in stretta prossimità sequenziale del punto di attacco dell'etichetta di spin siano significativamente ampliati e non siano rilevabili nello spettro. I residui che erano distanziati sequenzialmente dal punto di attacco ma mostravano una gamma migliorata erano spazialmente vicini all'etichetta di spin. Nel caso di proteine intrinsecamente disordinate, la registrazione e l'analisi dei purei produrrà informazioni sui contatti intramolecolari e sulle superfici di interazione transitoria.
La combinazione di misurazioni PRE con altri metodi biofisici come la diffusione dinamica della luce, la cromatografia ad esclusione dimensionale, l'ultracentrifugazione analitica e i metodi computazionali può fornire informazioni più approfondite. La misura PRE aiuta a caratterizzare lo stato transitorio scarsamente popolato. Questo approccio potrebbe essere ampliato per caratterizzare interazioni importanti per una miriade di processi biologici come il riconoscimento molecolare, la selezione conformazionale allosterica e i processi di assemblaggio, incluso l'assemblaggio di organelli senza membrana tramite separazione di fase.
