La termoforesi su microscala etichettata ottiene costanti di dissociazione, o KD, di diverse interazioni biochimiche in modo efficiente. Questo protocollo e il video accompagnato danno l'affinità approssimativa per Vam7, l'unica proteina SNARE solubile nel lievito, all'acido fosfatidico. Questo è il modo in cui Vam7 si associa a due membrane prima di interagire con altre proteine.
Questo metodo ottiene rapidamente KD per diverse interazioni biochimiche a basso costo, con alta riproducibilità e con un costo proteico minimo. Questa tecnica è adatta per lo sviluppo farmaceutico di prima fase, consentendo KD facilmente ottenibili per determinare potenziali composti di piombo. Prima di iniziare un'analisi, accendere l'interruttore di alimentazione sul retro del dispositivo MST e aprire il software di controllo.
Verificare che il computer sia collegato al dispositivo e in stato connesso e impostare MST Prima su 3 secondi, MST su 30 secondi e Ripristino fluorescenza su dopo 1 secondo. Per ogni tubo capillare, immettere il nome del ligando target, il nome dell'analita ligando, la concentrazione del bersaglio e la concentrazione di titolazione più alta utilizzando il rapporto di titolazione di riempimento automatico. Selezionare un intervallo di potenze MST e immettere i valori per ogni potenza per testare l'adattamento di rilegatura più robusto.
Per preparare campioni MST etichettati, diluire una soluzione di Vam7-ottastidina a una concentrazione di 200 nanomolari e un colorante NTA-Atto 647 a una concentrazione di 100 nanomolari, entrambi in PBS. Mescolare il Vam7-ottaistidina e il colorante NTA-Atto 647 con un rapporto volumetrico 1:1 e lasciare che la miscela rimanga a temperatura ambiente al riparo dalla luce per 30 minuti. Alla fine dell'incubazione, centrifugare la miscela di coloranti e proteine e conservare la soluzione a 4 gradi Celsius per un massimo di alcune ore prima dell'uso.
Quindi, preparare il campione, prelevare il ligando tinto ed esporre l'analita. Per la termoforesi su microscala del campione, aprire il dispositivo e far scorrere il rack capillare verso l'esterno. Caricare i capillari campione nel rack con la massima concentrazione in posizione uno e selezionare il canale rosso nel software di controllo.
Quindi, caricare il rack nello strumento. Quindi selezionare un intervallo di potenza MST e avviare la misurazione MST Cap Scan e valutare la risposta del cambio. Le tracce termoforetiche di uno studio di titolazione 1:1 di DiC8 PA a partire da 500 micromoli contro 50 nanomolari NTA-Atto 647 etichettati come dominio Vam7 sono mostrate qui.
La fluorescenza iniziale, il salto temporale e la termoforesi possono essere osservati, consentendo di calcolare KD da una qualsiasi o una combinazione di queste misurazioni. Da questi risultati è possibile tracciare una curva di saturazione, ad esempio per la termoforesi con l'output del salto temporale, come illustrato nel grafico. Generalmente, i risultati MST sono determinati utilizzando la scala logaritmica, tenendo conto della concentrazione proteica per determinare l'affinità di legame selezionando il modello KD e inserendo la concentrazione proteica.
Quando si esegue questo protocollo, assicurarsi che la soluzione sia al centro del capillare e che non ci siano bolle d'aria e che il capillare non abbia polvere o soluzione all'esterno del capillare. La calorimetria a titolazione isotermica o la risonanza plasmonica di superficie potrebbero essere utilizzate per convalidare il KD sperimentale ottenuto. Se esiste un potenziale legame cooperativo, ITC sarebbe il metodo logico successivo eseguito, date le risorse.
Questa tecnica ha permesso ai ricercatori di biologia tradizionale di incorporare tecniche di screening biofisico nella loro ricerca per determinare le relazioni di percorso. Un esempio di questa tecnica è la lisasi cellulare con la proteina bersaglio espressa endogenamente, dove il tag GFP è un nuovo modo per eseguire un tradizionale test di pull-down.
