Questo metodo risolve un problema comune sul campo e fornisce un flusso di lavoro completo per l'isolamento rapido e la caratterizzazione di singole vescicole extracellulari con marcatori specifici di interesse. L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle è un metodo semi-automatizzato. Utilizza le proprietà dello scattering della luce e del moto browniano per analizzare la distribuzione delle dimensioni delle vescicole extracellulari.
A dimostrare la procedura sarà Vera Schmidt, dottoranda del nostro laboratorio. Per isolare le vescicole extracellulari, dopo aver raccolto due campioni di millilitro di sangue intero umano in tubi di separazione del siero, lasciare coagulare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente prima di separare le cellule dal siero mediante centrifugazione. Trasferire un millilitro di siero da ciascun campione in singoli tubi di reazione da 1,5 millilitri per la centrifugazione per rimuovere le piastrine e trasferire 100 microlitri del plasma povero di piastrine in nuovi tubi di reazione da 1,5 millilitri.
Successivamente, aggiungere 25 microlitri di soluzione di precipitazione esosoma al plasma e vortice accuratamente i campioni. Dopo un'incubazione di 30 minuti sul ghiaccio, raccogliere le vescicole extracellulari per centrifugazione. Il pellet apparirà come un colore beige o bianco.
Aspirare il supernatante e centrifugare di nuovo il campione. Quindi, rimuovere tutte le trance di fluido e rimosogliere il pellet in 100 microlitri di PBS. Per macchiare le membrane cellulari delle vescicole, aggiungere 10 microlitri della sospensione EV a 50 microlitri di soluzione colorante etanolanica PKH67 appena preparata e mescolare accuratamente.
Dopo cinque minuti a temperatura ambiente al buio, diluire 50 microlitri della sospensione vescicolare extracellulare macchiata con 2,5 millilitri di acqua distillata in un tubo conico da 15 millilitri, con miscelazione accurata. Per etichettare le vescicole con anticorpi, diluire da 10 a 20 microlitri della sospensione extracellulare di vescicola non macchiata con 50 microlitri di acqua distillata in un tubo di reazione da 1,5 millilitri, con miscelazione accurata. Aggiungere da 2,5 a cinque microlitri dell'anticorpo di interesse per il tubo di reazione, con miscelazione accurata, per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
Quindi, trasferire 50 microlitri delle vescicole etichettate in un tubo conico da 15 millilitri contenente l'adeguato volume sperimentale di acqua distillata, con miscelazione accurata, come indicato nella tabella. Prima di analizzare le vescicole extracellulari macchiate o etichettate, spostare prima il filtro a fluorescenza nel percorso ottico del microscopio e della fotocamera e avviare il programma, seguendo le istruzioni sullo schermo per l'implementazione automatizzata. Nella scheda Controllo cella selezionare il numero di cella corretto per la misurazione della fluorescenza e la posizione di riferimento per l'ottica, per confermare che il laser e il microscopio sono in una messa a fuoco comune.
Utilizzare una siringa per sciacquare il canale cellulare con 10 millilitri di acqua distillata, facendo attenzione che la cella di misura sia priva di bolle d'aria e che le bolle d'aria non siano iniettate nel sistema. Successivamente, diluire 10 microlitri di particelle di polistirene etichettate a fluorescenza di dimensioni di 200 nanometri in 990 microlitri di acqua distillata e aggiungere 10 microlitri di questa sospensione di particelle in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di acqua distillata. Quindi, iniettare 2,5 millilitri della prima soluzione di particelle diluite nel canale della cella e fare clic su Ottimizza messa a fuoco per regolare la fotocamera.
Per misurare il campione, sciacquare il canale cellulare più volte con 10 millilitri di acqua distillata e iniettare la sospensione vescicolare extracellulare macchiata. Utilizzando la posizione di riferimento, regolate i parametri di acquisizione appropriati nella scheda Controllo cella (Cell Check), come indicato nella tabella. Per identificare l'intervallo di sensibilità ottimale, fate clic su Numero di particelle (Number of Particles vs).
Sensibilità, per visualizzare una curva delle particelle misurate per schermo per i diversi livelli di sensibilità. Per il parametro Shutter, regolare il periodo di tempo in cui la fotocamera consente alla luce di passare per un intervallo determinato. Per i parametri di postacquisizione, selezionare una luminosità minima di 20, una dimensione minima di 20 nanometri e una dimensione massima di misura di 500 nanometri.
Si noti il numero di particelle rilevate nel campo visivo del display. La barra di dispersione deve essere dal verde all'arancione, da 50 a 300 particelle. Fate clic su Controlla deriva particelle a volt zero (Check Particle Drift at Zero Volts) e aprite la scheda Misura (Measurement).
Fate clic su Esegui acquisizione video (Run Video Acquisition) e impostate il numero di esperimenti su tre a cinque e il ritardo tra gli esperimenti su zero minuti. Impostare il numero di singole posizioni subvolume su 11 e il numero di cicli di misurazione su 10 in ogni posizione di misurazione in cui le particelle devono essere analizzate. Selezionare quindi una cartella, creare un nuovo nome di file e fare clic su OK per avviare la misurazione.
Al termine dell'analisi, aprire la scheda Analisi per esaminare i risultati. Quindi, controllare il numero medio di particelle per posizione, il numero totale di particelle tracciate e la concentrazione di particelle, la larghezza di distribuzione delle particelle, il valore della media e la deviazione standard. L'utilizzo di perline fluorescenti per la regolazione e la calibrazione della misurazione offre una sensibilità di impostazione ottimale dell'85%Utilizzando queste impostazioni, la fotocamera visualizza un'immagine nitida e le misurazioni ripetute dimostrano una deviazione standard bassa.
La colorazione con un kit di linker cellulare che include un linker cellulare fluorescente che incorpora un colorante fluorescente verde con lunghe code alifatiche nelle regioni lipidiche della membrana cellulare, rivela una forte correlazione tra la sensibilità e il numero di particelle misurate. L'anticorpo di colorazione vescicolare extracellulare contro una proteina di interesse indica una distribuzione di particelle da 220 a 1.145 nanometri, con una dimensione massima massima di picco di 541 nanometri. Non vengono rilevate vescicole extracellulari dopo la colorazione degli anticorpi dell'acqua priva di vescicole di controllo, fino a una sensibilità vicina al 100%Se la misurazione viene avviata quando la deriva è superiore a 5 micrometri al secondo, le ripetizioni individuali dimostrano deviazioni distinte.
È importante notare che l'uso dell'isotiocianato di fluoresceina come fluorocromo si traduce in misurazioni imprecise e non riproducibili, poiché questo fluorofo è soggetto a un rapido fotoblema. Questo protocollo risponde alla domanda principale di molti ricercatori in questo campo per una rapida caratterizzazione di singole vescicole extracellulari, utilizzando marcatori specifici. Nonostante il fatto che, nell'ultimo decennio, i metodi siano notevolmente migliorati, non esiste ancora un protocollo standardizzato per l'analisi delle singole vescicole extracellulari.
Indipendentemente dai futuri progressi della ricerca sulla biologia vescicolare extracellulare, questo metodo fornisce un protocollo rapido e affidabile per la caratterizzazione di singole vescicole extracellulari utilizzando marcatori specifici. Poiché i nostri protocolli attuali non comportano lunghi tempi di elaborazione o passaggi ad alta intensità di manodopera, sono adatti anche per un'elevata produttività del campione.
