Gli autori desiderano ringraziare Dale Hirschkorn da sistemi Sangue Research Institute per il suo aiuto con citofluorimetro impostazioni dello strumento. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede HL095470 e U01 HL072268 e contratti DoD W81XWH-10-1-0023 e W81XWH-2-0028.

NOTA: I seguenti protocolli sono stati eseguiti in conformità a tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. Tutti i campioni soggetti umani sono stati testati in un comitato di revisione istituzionale (IRB) Protocollo -approvato e con il consenso informato dei soggetti. 1. METODO A: Individual Metodo di rilevazione 1.1) Elaborazione di Campione di sangue / isolamento dei veicoli elettrici <ol><li> Disegnare sangue dal donatore / paziente in due tubi di vetro da 10 ml contenente 1,5 ml di ACD-A o altra soluzione adatta anticoagulante e processo immediatamente (entro 30 min max) utilizzando il seguente protocollo centrifugazione differenziale 2-step. NOTA: Questo protocollo produrrà circa 10 ml di plasma povero di piastrine (PPP) dalle combinate ~ 17 ml di sangue disegnate. Se è necessaria più o meno PPP, il numero di tubi di sangue raccolto può essere regolata di conseguenza. </li><li> Centrifugare i campioni a 1.500 xg per 10 min a RTper separare il plasma dal buffy coat e globuli rossi. Trasferire 1,2 ml aliquote del surnatante del plasma di 1,5 ml provette, facendo attenzione a non disturbare gli strati inferiori contenenti il ​​buffy coat e globuli rossi. </li><li> Spin a 13.000 xg per 10 min a RT per rimuovere le piastrine e frammenti di cellule di grandi dimensioni. Trasferire con cura il PPP, lasciando dietro di sé 200 microlitri per non disturbare il pellet e aggiungere il PPP ad un nuovo tubo. </li><li> A questo punto, utilizzare PPP immediatamente per l&#39;analisi o il trasferimento in 1,0 ml aliquote di nuovi 1,5 ml provette e conservare a -80 ° C per un massimo di due anni per una successiva analisi (fare riferimento alla figura 1A per una panoramica). </li><li> Se sono necessarie EV purificate per esperimenti funzionali, di trasferimento di 6 ml di PPP per un tubo ultracentrifuga e aggiungere 28 ml di 0,2 tampone fosfato micron filtrata (PBS). Spin per 60 min a 100.000 xg a temperatura ambiente usando una un&#39;ultracentrifuga dotato di un rotore oscillante secchio. Aspirare il surnatante e risospendere EV pellasciate in 1,5 ml media. NOTA: Per la massima riproducibilità, i campioni di sangue devono essere trattati nel modo più coerente possibile dal donatore al donatore. Ogni variazione nel metodo di isolamento EV potrebbe avere un impatto significativo il numero e il tipo di veicoli elettrici rilevati. </li></ol> 1.2) la preparazione dei campioni per l&#39;analisi NOTA: Da questo punto in poi, i passaggi spiegare un protocollo ad alta produttività per analizzare 12 campioni per 14 marcatori in 3 pannelli. Tuttavia, altre combinazioni di anticorpi possono essere usati qui; il protocollo può essere adattato per studiare altre popolazioni EV sostituendo i marcatori suggeriti per quelli di interesse. <ol><li> Rimuovere 12 campioni dal congelatore (se conservato a -80 ° C) e scongelare a 37 ° C. </li><li> Contenuti pipetta su e giù più volte per mescolare. Togliere 320 ml da ogni campione e aggiungere alla riga superiore di una piastra ben 96. NOTA: Un multi-ben pipetta larghezza regolabile è estremamente utile per questo e molti altri passi in tutto il culoay, soprattutto quando si analizzano più campioni contemporaneamente. </li></ol> 1.3) colorazione EV Campioni <ol><li> Prima della colorazione, filtrare tutti gli anticorpi (Abs) per rimuovere gli aggregati, che può causare segnali positivi. <ol><li> Anticorpi combinano per essere utilizzati in ciascuno dei 3 pannelli in 0,22 micron tubi filtranti centrifughi separati e centrifugare utilizzando un angolo fisso centrifuga singola velocità (~ 750 xg) a temperatura ambiente per 2 minuti, o fino a quando tutta la miscela Ab è passato attraverso il filtro e nessun liquido anticorpi rimane sulla superficie del filtro. Conservare cocktail Ab in frigorifero per un massimo di due settimane, ma ri-filtro ogni volta prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Aggiungere la quantità appropriata di miscela Ab filtrato ad ogni pozzetto nella fila 2 (ad esempio, i campioni in Pannello I sono colorate con 2 ml di ogni Ab, così si aggiunge un totale di 12 ml di cocktail Ab filtrato per bene remare 2). Fare riferimento alla Figura 1B per un contorno di mappa piatto suggerito. Ripetere questi aggiuntas per le righe sotto se più pannelli vengono eseguiti (qui, aggiungere 8 ml / pozzetto del cocktail Panel II alla riga 3 e 11 ml / pozzetto del cocktail Panel III a remare 4; fare riferimento a Materiali Lista per informazioni specifiche del pannello). </li><li> Utilizzando la pipetta multicanale, miscelare i campioni PPP in riga 1 su e giù e trasferire 100 ul dai pozzi in riga 1 per i pozzi in fila 2. Mescolare su e giù. Cambia suggerimenti e ripetere, trasferendo 100 ml dalla fila 1 alla fila 3 e 4. Incubare a 4 ° C per 30 minuti. </li></ol> 1.4) lavaggio MT Campioni <ol><li> Rimuovere la piastra a 96 pozzetti da 4 ° C e trasferimento in cella di sicurezza biologica. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 220 ml di PBS / bene alle righe 6-8 (da utilizzare per il risciacquo / lavaggio dei pozzetti contenenti macchiato PPP). </li><li> Trasferire il contenuto di ogni ben di tubi filtranti centrifughe pre-etichettati con la pipetta multicanale larghezza regolabile (per 12 campioni, con 3 pannelli di anticorpi, 12 x 3 = 36 tubi filtroessere necessario). Utilizzando gli stessi suggerimenti, togliere 200 ml di PBS dai filari di lavaggio e aggiungere ai pozzetti da cui PPP è stato appena rimosso. </li><li> Mescolare su e giù per sciacquare i pozzi e trasferire la soluzione di risciacquo per gli stessi filtri a cui il PPP è stato precedentemente aggiunto. Chiudi cime di filtri centrifughi. Cambia suggerimenti. </li><li> Ripetere questa operazione con i restanti campioni macchiati fino a quando tutti i campioni di PPP colorati sono stati trasferiti con le loro soluzioni di risciacquo ai filtri centrifughi. </li><li> Trasferire i filtri centrifughi ad una centrifuga rotore fisso e centrifugare a 850 xg per 3 min a RT. NOTA: Assicurarsi che rimanga liquido sulle cime del filtro. Dopo centrifugazione, il filtro deve apparire &quot;secco&quot; senza strato fluido rimanente visibile sulla parte superiore. Sebbene improbabile, alcuni campioni PPP possono richiedere un tempo più lungo per centrifugazione spostare efficacemente attraverso il filtro. </li><li> Rimuovere i tubi filtranti centrifughe e tornare alla cappa di sicurezza biologica.Utilizzando la pipetta multicanale, sospendere nuovamente le cime dei filtri in 300 ml di PBS. Trasferire il contenuto in sospensione al tubi pre-etichettati per l&#39;immediata analisi FCM. NOTA: E &#39;molto importante mantenere la forza e il numero di depressioni pipetta stantuffo coerenti tra campioni per evitare variazioni campione a campione. Questo dovrebbe idealmente essere fatto utilizzando una pipetta elettronico che è stato programmato per pipettare su e giù un volume specifico (ad esempio, 280 microlitri) un numero esatto di volte (ad esempio, 8 volte) per ogni campione. </li></ol> 1.5) Citometro Setup <ol><li> Aprire il software FCM. Prima di sperimentare l&#39;installazione, eseguire la calibrazione dello strumento quotidiano e configurazione utilizzando perline di impostazione strumento (seguendo le istruzioni del produttore). </li><li> Se i campioni EV sono state colorate con più di un anticorpo e molteplici fluorocromi sono da misurare contemporaneamente, calcolare valori di compensazione come segue: <ol><li> Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione di preTubi -labeled (1 tubo per ogni anticorpi coniugati a fluorocromi) e aggiungere la quantità raccomandata di anticorpi. Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione negativi a un altro tubo da utilizzare come il controllo di compensazione senza macchia. </li><li> Incubare a 4 ° C per 30 minuti, lavare con PBS e risospendere in 400 ml di PBS. </li><li> Utilizzando il citofluorimetro software fornito con lo strumento, eseguire ogni tubo di compensazione e regolare tensioni fluorescenti per posizionare ogni picco di circa 10 4 su una scala logaritmica 5-decade. Assicurarsi che il picco di fluorescenza è più elevata (più luminoso) in un proprio canale fluorescente rispetto a tutti gli altri canali, e regolare le tensioni di parametri fluorescenti di nuovo se necessario. Eseguire ogni tubo bozzetto singolarmente macchiato e catturare almeno 5.000 eventi per il tubo. </li><li> Selezionare &quot;Experiment&quot;, scheda e selezionare &quot;compensazione&quot;, quindi selezionare &quot;Calcola compensazione&quot; per applicare valori di compensazione per tutti i campioni. </li></ol></li><li&gt; Impostare la dispersione in avanti (FSC) e side scatter (SSC) parametri di tensione per accedere scala e selezionare le soglie più basse consentite dal citometro (FSC = 200 e SSC = 200) per ciascuna. </li><li> Durante l&#39;esecuzione di un tubo di 0,22 micron filtrata PBS, regolare le tensioni FSC e SSC per i valori più alti che escludono la maggior parte del rumore di fondo (cioè, appena sotto la soglia di tensione a cui tasso di eventi supera 5 eventi / sec). </li><li> Successivamente, eseguire una provetta contenente 0,2 micron - 1,0 micron perline, diluito in PBS, se necessario. In un FCS e SSC plot, disegnare un cancello intorno popolazione tallone per acquisire gli eventi tra 0,2 micron e 1,0 micron. In alternativa, in un istogramma SSC-H, disegnare un cancello per includere tutti gli eventi più piccoli rispetto ai 1,0 micron perline. </li><li> Impostare la portata del citometro a &quot;Lo&quot; (circa 8-12 ml / min). Usando il tubo perline (o altro tubo contenente una concentrazione nota di perline) regolare il selettore portata sul citometro fino alla vigiliatasso nt raggiunge circa 200 eventi / sec. Leggi tutte le provette dei campioni alla stessa velocità di flusso e utilizzare la stessa concentrazione tallone in esperimenti futuri per garantire che i flussi restano coerenti tra le esecuzioni. </li><li> Eseguire un tubo di particelle fluorescenti arcobaleno diluito in PBS. Acquisire 5.000 eventi. Registrare i valori di intensità media per FSC, SSC, e ciascun canale di colore. Utilizzare questi valori per regolare tensioni in esperimenti futuri per garantire che intensità di fluorescenza restano coerenti tra esperimenti. </li></ol> 1.6) lettura del campione <ol><li> Impostare la portata del citometro a &quot;Lo&quot; (circa 8-12 ml / min) ed eseguire ogni campione per esattamente 1 o 2 minuti. </li><li> Dopo la prima lettura, aggiungere 20 ml di 10% NP-40 per ciascun campione, pipetta su e giù, e rileggere per la stessa quantità di tempo (1 o 2 min) per consentire la sottrazione di eventi positivi rilevati in il campione lisato su un lasso di tempo uguali. NOTA: E &#39;estremamente important che i campioni essere miscelati utilizzando una pipetta piuttosto che un vortice. Nella nostra esperienza, vortex può provocare auto-aggregazione di alcuni anticorpi, portando a eventi positivi-EV imitando. </li><li> Una volta che tutti i campioni sono stati letti, esportare tutti i file .fcs in un file separato da utilizzare per ulteriori analisi utilizzando il software di analisi FCM. </li></ol> 1.7) Analisi dei dati <ol><li> Aprire il software di analisi FCM. Importare tutti i file .fcs in un nuovo file esperimento. </li><li> Aprire il perline solo tubo. Nel FSC-A vs SSC-A plot, disegnare un cancello intorno a tutte le perle di dimensioni tra 0,2 micron e 1,0 micron. Questa è la porta EV. Trascinate da aggiungere a tutti i campioni. </li><li> Utilizzando i campioni lisati come controlli negativi, elaborare porte sul bordo della fluorescenza di fondo in ciascun canale fluorescenza utilizzato. Trascinare cancelli fluorescenti nella gate EV di ogni campione non lisato corrispondente. NOTA: A questo punto è anche utile esaminare dual fluorescenti trame bi-parametri. Forme Rocket inil quadrante a doppio positivo (vedi figura 8), in particolare se i marcatori sono noti a risiedere in tipi di cellule indipendenti, possono essere indicativi di artefatto da aggregazione o altri eventi-vescicole imitando. </li><li> Per ciascun marcatore fluorescente, sottrarre il numero di eventi nel campione lisato dal numero di eventi nel campione non lisato. Facoltativamente, dividere questo numero per il numero totale di veicoli elettrici all&#39;interno del cancello non lisati EV per ottenere valori positivi%. </li></ol> 2. METODO B: Metodo Beads 2.1) Elaborazione di Campione di sangue / isolamento dei veicoli elettrici <ol><li> Fare riferimento al metodo di lavorazione del sangue descritto nel metodo A (sezione 1.1). </li></ol> 2.2) la preparazione dei campioni per l&#39;analisi <ol><li> Se lo si desidera, frazionare PPP o EV ultracentrifugato in esosomi e microvescicole. Aggiungere 250 ml di PPP o EV ultracentrifugato a 0.22 micron filtri centrifughi e trasferimento in una centrifuga del rotore fisso e far girare a 750 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Assicurarsi che rimanga liquido sulle cime del filtro. Dopo centrifugazione, il filtro deve apparire &quot;secco&quot; senza strato fluido rimanente visibile sulla parte superiore. Sebbene improbabile, alcuni campioni possono richiedere un tempo di centrifugazione leggermente più lungo per il fluido di muoversi efficacemente attraverso il filtro. </li><li> Lavare patinati 6 micron perle di polistirene (per esempio, perle negative ABC) 2x con i media RPMI e risospendere in 2 ml. Aggiungi 6.000 perline per ogni provetta FACS. Per la provetta di controllo negativo, aggiungere 400 ml di RPMI supporto solo ai talloni. Per tutti gli altri tubi, aggiungere 200 ml di PPP o di veicoli elettrici ultracentrifugato (o loro frazioni) e 200 ml di RPMI media. </li><li> Regolare il volume finale di tutte le provette a 400 microlitri con media e incubare una notte a 4 ° C su un agitatore. </li><li> La mattina dopo, lavare perline con 2 ml di media. Aspirare il surnatante. </li><li> Blocco con 5% di siero albumina bovina (BSA) in mezzi (400 ml) per 3 ore a 4 &amp;# 176; C su un agitatore. </li><li> Lavare perline con 2 ml di media. Aspirare e risospendere pellet in 100 ml di media. </li></ol> 2.3) I campioni di colorazione EV <ol><li> Filtrare tutti gli anticorpi. Utilizzare gli stessi pannelli di anticorpi utilizzati nel metodo A, o se desiderato, creare una diversa combinazione di anticorpi finché loro fluorocromi sono compatibili tra loro. </li><li> Combinare tutti gli anticorpi da utilizzare in un unico pannello in un tubo filtro centrifugo 0,22 micron. Centrifugare utilizzando un angolo fisso centrifuga singola velocità per 2 minuti o fino a quando tutta la miscela Ab è passato attraverso il filtro e nessun liquido anticorpi rimane sulla superficie del filtro. </li><li> Aggiungere il volume appropriato di cocktail di anticorpi filtrato a tutte le provette e incubare per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare perline con 2 ml di mezzi, risospendere in 400 ml di mezzi ed eseguire immediatamente (o entro il giorno stesso) sul citofluorimetro. </li></ol> 2.4) Cytometer Setup e Sample Reading<ol><li> Aprire il software FCM. Prima di sperimentare l&#39;installazione, eseguire la calibrazione dello strumento quotidiano e configurazione utilizzando perline di impostazione strumento (seguendo le istruzioni del produttore). </li><li> Se i campioni EV sono state colorate con più di un anticorpo e molteplici fluorocromi sono da misurare contemporaneamente, calcolare valori di compensazione come segue: <ol><li> Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione per i tubi pre-etichettati (1 tubo per ogni anticorpi coniugati a fluorocromi) e aggiungere la quantità raccomandata di anticorpi. Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione negativi a un altro tubo da utilizzare come il controllo di compensazione senza macchia. Incubare a 4 ° C per 30 minuti, lavare con PBS e risospendere in 400 ml di PBS. </li><li> Utilizzando il software FCM, eseguire ogni tubo di compensazione e regolare tensioni fluorescenti per posizionare ogni picco di circa 10 4 su una scala logaritmica 5-decade. Assicurarsi che il picco di fluorescenza è più elevata (più luminoso) in un proprio canale fluorescente rispetto a tutti gli altri canali, eregolare le tensioni di parametri fluorescenti nuovo se necessario. Eseguire ogni tubo bozzetto singolarmente macchiato e catturare almeno 5.000 eventi per il tubo. </li><li> Selezionare la scheda &quot;Experiment&quot;, quindi &quot;Compensation&quot;, poi &quot;Calcola compensazione&quot; per applicare valori di compensazione per tutti i campioni. </li></ol></li><li> Cambiare la FSC e parametri di tensione SSC per accedere scala e selezionare le soglie più basse consentite dal citometro (FSC = 200 e SSC = 200) per ogni. </li><li> Campioni Run, porta sulla popolazione perline singoletto e acquisire 2.000 eventi in questa porta. File di esportazione .fcs. </li><li> Utilizzare software di analisi FCM per analizzare .fcs file. Gate perline singoletto. Calcolare l&#39;intensità geometrica fluorescenza media (MFI) per ogni fluorocromo e confrontare con la MFI del controllo negativo. </li></ol>

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M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+discovery+of+21+proteins+expressed+in+human+plasma-derived+but+not+platelet-derived+microparticles.">Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).</li><li>Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Limitations+of+Microparticle+Measurement+by+Flow+Cytometry.">Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).</li><li>Mobarrez, F., Antovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+flow+cytometric+assay+for+measurement+of+platelet-derived+microparticles.">A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).</li><li>Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Szab&#243;, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Flow+Cytometric+Assessment+Reveals+Distinct+Microvesicle+(Cell-Derived+Microparticle)+Signatures+in+Joint+Diseases.">Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., M&#243;dos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+isolation+of+cell-derived+microparticles+are+compromised+by+protein+complexes+resulting+from+shared+biophysical+parameters.">Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters.</a> Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response:+systematic+use+of+Triton+lysis+as+a+control+for+microvesicle+labeling.">Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling.</a> Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).</li><li>Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+controls+in+phenotyping+and+quantification+of+microparticles:+a+major+source+of+error+and+how+to+evade+it.">Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).</li><li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes.">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li><li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V,+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib.">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li><li>Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van der Vlist, E. J., Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma.">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li></ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interesse a divulgare.

Sono stati presentati due diversi protocolli per l&#39;isolamento, il trattamento e l&#39;analisi dei veicoli elettrici, utilizzando un rilevamento individuo o approccio basato bead-. Selezione del metodo più appropriato utilizzare non è sempre agevole e richiede una comprensione del campione in prova nonché le singole sottopopolazioni di interesse. Inoltre, la sensibilità del citometro utilizzato per l&#39;acquisizione deve essere considerato nella scelta del metodo più appropriato. Spesso non c&#39;è miglior pro...

Extracellulare vescicole (EV) sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono altamente coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici. Analisi dei veicoli elettrici che utilizzano citometria a flusso (FCM) è notoriamente difficile a causa delle loro piccole dimensioni e la mancanza di popolazioni distinte positive per i marcatori di interesse. Metodi di analisi EV, mentre notevolmente migliorato nel corso dell&#39;ultimo decennio, sono ancora un work in progress. Purtroppo, non vi è alcun one-size-fits-all protocollo, e molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Presentato qui sono diverse tecniche per i veicoli elettrici di trasformazione e di due protocolli per l&#39;analisi i veicoli elettrici utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-. I metodi descritti qui assisterà con eliminando gli aggregati anticorpali trovano comunemente in preparazioni commerciali, aumentando il rapporto segnale-rumore, e cancelli impostazione in un f razionaleashion che riduce al minimo il rilevamento della fluorescenza di fondo. Il primo protocollo utilizza un metodo di rilevamento individuo che è particolarmente adatto per l&#39;analisi di un elevato volume di campioni clinici, mentre il secondo protocollo utilizza un approccio basato tallone a catturare e rilevare EVs piccole e exosomes. EV, noto anche come microparticelle, sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici 1. Attraverso l&#39;espressione di diversi marcatori di superficie e / o il trasferimento diretto di materiale biologico, i veicoli elettrici sono in grado di alterare la funzione delle cellule riceventi di giocare sia attivare o sopprimere ruoli nella comunicazione intercellulare 2-4. Clinicamente, veicoli elettrici di derivazione piastrinica sono noti per avere una forte attività anticoagulante 5, mentre altri hanno dimostrato di contribuire a una vasta gamma di condizioni, dalla promozione del tumore metastasis 6 per la protezione contro le malattie 7. Veicoli elettrici possono essere classificati in categorie più piccole di vescicole cellulari di derivazione, come esosomi e microvescicole (MV), a seconda delle loro dimensioni e il meccanismo di generazione 8. La nomenclatura di sottopopolazioni vescicole cellule derivate continua ad essere un argomento di dibattito in corso 8,9, tuttavia, esosomi sono generalmente descritti come piccoli, 40 a 100 particelle nm derivati ​​da fusione endosomal con la membrana plasmatica, mentre MV sono più grandi da 100 a 1.000 particelle nm formate versando della membrana plasmatica 10. Qui, il termine generico &quot;EV&quot; verrà utilizzato per riferirsi a tutti i tipi di vescicole biologici extracellulari rilasciate dalle cellule. Isolamento dei veicoli elettrici da sangue intero è una procedura a più fasi e molte variabili di elaborazione diversi hanno dimostrato di influenzare il contenuto EV, tra cui temperatura di conservazione e la durata 11,12, anticoagulante / conservante usato 13 eMetodo di centrifugazione utilizzato 14. La necessità di standardizzazione di queste variabili ha portato a raccomandazioni della Società Internazionale sulla Trombosi e lavorazione del sangue e isolamento EV comitato di normalizzazione (ISTH SSC) per la corretta Emostasi scientifici e le procedure di 15,16, ma non esiste alcun consenso tra i ricercatori sul protocollo ottimale utilizzare 12. La maggior parte d&#39;accordo, tuttavia, che le variabili pre-analitiche strettamente controllate sono cruciali per dati accurati e riproducibili. Per analizzare i veicoli elettrici, i ricercatori hanno utilizzato vari metodi, tra cui microscopia elettronica a trasmissione 17, microscopia elettronica a scansione 18,19, microscopia a forza atomica, luce dinamica spargendo 20,21 e occidentale blotting 22,23. Mentre FCM è il metodo di scelta per molti ricercatori 9,24 - 26 grazie alle sue elevate capacità di throughput, l&#39;analisi dei veicoli elettrici che utilizzano FCM è statonotoriamente difficile a causa delle loro dimensioni e la mancanza di discrete popolazioni positive 27-32. Rispetto alle analisi di cellule, la piccola dimensione delle EVs risultati in 1) meno fluorescenza emessa a causa del minor numero di antigeni per particella e 2) la fattibilità limitato di post-macchia di lavaggio, che è necessaria per ridurre fluorescenza di fondo. Sfide comuni tra i ricercatori sono i segnali derivanti da aggregati di immunoglobuline 27,28 e di auto-aggregazione di anticorpi 29. Inoltre, i lunghi tempi di lavorazione e lunghe procedure di lavaggio / isolamento utilizzati da molti dei protocolli attuali 33,34 richiedono impegni di tempo più giorni per analizzare un piccolo numero di campioni, rendendoli meno che ideale per applicazioni ad alta produttività. Alcuni ricercatori rinunciano una fase di lavaggio del tutto, rendendo utilizzati tradizionalmente controlli negativi FCM, come una fluorescenza meno (FMO) e isotipi anticorpali inutile per valutare con precisione bacfluorescenza kground 30. I nostri protocolli affrontano tre problemi comuni che possono impedire la corretta analisi FCM dei veicoli elettrici: segnali derivanti da aggregati di anticorpi e altri non-vescicole, difficoltà nel rimuovere l&#39;anticorpo non legato, e la mancanza di popolazioni positive distinguibili. Le tecniche qui descritte assisterà con eliminando gli aggregati anticorpali trovano comunemente in preparazioni commerciali, aumentando il rapporto segnale-rumore, e impostando cancelli in modo razionale che minimizza rilevamento di fluorescenza di fondo. Due diversi metodi di rilevamento sono presentati qui: il primo protocollo utilizza un metodo di rilevamento individuo che è particolarmente adatto per l&#39;analisi di un elevato volume di campioni clinici, mentre il secondo protocollo utilizza un approccio basato perline per catturare e rilevare EVs piccole e exosomes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >LSR II benchtop flow cytometer</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FACS Diva software&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >PC version 6.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FlowJo software&#160;</td>
			<td >Treestar US</td>
			<td ></td>
			<td >Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sphero Rainbow fluorescent particles</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >556298</td>
			<td >used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra Rainbow fluorescent particles&#160;</td>
			<td >Spherotech</td>
			<td >URFP-10-5</td>
			<td >used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Megmix-Plus SSC beads</td>
			<td >Biocytex</td>
			<td >7803</td>
			<td >used to adjust FSC and SSC&#160; voltages to maintain&#160; consistency&#160; between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AbC Anti-Mouse Bead Kit</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-10344</td>
			<td >used for compensation controls &#38; negative AbC beads used for beads-based method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td>
			<td >Santa Cruz&#160;</td>
			<td >sc-281108</td>
			<td >used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD TruCOUNT Tubes</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340334</td>
			<td >used whenver absolute EV concentrations are needed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrafree-MC, GV 0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td >Millipore&#160;</td>
			<td >UFC30GVNB</td>
			<td >used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >364606</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Facs tubes 12x75 polystrene</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >352058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50mL Reservoirs individually wrapped&#160;</td>
			<td >Phenix</td>
			<td >RR-50-1s</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips - 10&#181;L</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L10S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips -200&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L250S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green -Pak pipet tips - 1000&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L1000S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stable Stack L300 tips presterilized</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >SS-L300S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet-Lite&#160;XLS 8 Channel LTS&#160;Adjustable&#160;Spacer&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >LA8-300XLS</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well tissue culture plates</td>
			<td >E&#38;K Scientific</td>
			<td >EK-20180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Media (without Hepes)</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAE001</td>
			<td >media used for bead-based detection method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2&#181;m filtered</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAL003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear</td>
			<td >BECKMAN COULTER INC</td>
			<td >344058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL I</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 PerCP-Cy5.5</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >344808</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD14 APC-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301820</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD16 V450</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >560474</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >302906</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD152 APC</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555855</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD19 A700</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >302226</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL II</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD41a PerCP-Cy5.5</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340930</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62L APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304810</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD108 PE&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >552830</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD235a FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >349104</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL III</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD11b PE-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301322</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62p APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304910</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD66b PE&#160;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >305106</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD15 FITC</td>
			<td >exalpha</td>
			<td >X1496M</td>
			<td >5 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD9 PE</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >555372</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD63 APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >353008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC-Cy7 Ms IgG2a, &#954;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >400230</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry

Extracellulare vescicole (EV) sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono altamente coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici. Analisi dei veicoli elettrici che utilizzano citometria a flusso (FCM) è notoriamente difficile a causa delle loro piccole dimensioni e la mancanza di popolazioni distinte positive per i marcatori di interesse. Metodi di analisi EV, mentre notevolmente migliorato nel corso dell&#39;ultimo decennio, sono ancora un work in progress. Purtroppo, non vi è alcun one-size-fits-all protocollo, e molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Presentato qui sono diverse tecniche per i veicoli elettrici di trasformazione e di due protocolli per l&#39;analisi i veicoli elettrici utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-. I metodi descritti qui assisterà con eliminando gli aggregati anticorpali trovano comunemente in preparazioni commerciali, aumentando il rapporto segnale-rumore, e cancelli impostazione in un f razionaleashion che riduce al minimo il rilevamento della fluorescenza di fondo. Il primo protocollo utilizza un metodo di rilevamento individuo che è particolarmente adatto per l&#39;analisi di un elevato volume di campioni clinici, mentre il secondo protocollo utilizza un approccio basato tallone a catturare e rilevare EVs piccole e exosomes.

<html> Figura 1 illustra lo schema di elaborazione globale per l&#39;isolamento e la rilevazione dei veicoli elettrici utilizzando sia il metodo basato bead-o metodo di rilevamento individuale. Rilevazione individuale dei veicoli elettrici che utilizzano FCM funziona bene per l&#39;analisi dei veicoli elettrici più grandi, ma la maggior parte dei citometri non sono in grado di rilevare singolarmente particelle piccolo come esosomi. Un approccio basato branello-permette piccoli EVs da rilevare, però, ci...

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Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Esistono molti metodi diversi per la misurazione delle vescicole extracellulari (EV) con citometria a flusso (FCM). Molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Due protocolli per i veicoli elettrici di misurazione sono presentate, utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-.

Tecniche per l&#39;Analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

techniques-for-analysis-extracellular-vesicles-using-flow

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K Views.  Blood Systems Research Institute.  Esistono molti metodi diversi per la misurazione delle vescicole extracellulari (EV) con citometria a flusso (FCM). Molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Due protocolli per i veicoli elettrici di misurazione sono presentate, utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-. 

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Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Ricerca

Biologia

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Monitoraggio temporale del ciclo cellulare progressione citometria a flusso, senza la necessità di sincronizzazione

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Preparazione del campione per l&#39;analisi di massa Citometria

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Thermo flusso LED - La combinazione Optogenetics con citometria a flusso

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificazione e analisi di Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Analisi di tracciamento delle nanoparticelle per la quantificazione e la determinazione delle dimensioni delle vescicole extracellulari

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and first-generation particle analysis to comprehensive multi-parameter measurements such as nano-flow cytometry (nFCM). nFCM is a form of flow cytometry that utilizes instrumentation specifically designed for nano-particle analysis, allowing for thousands of EVs to be characterized per minute both with and without the use of staining techniques. High resolution side scatter (SS) detection allows for size and concentration to be determined for all biological particles larger than 45 nm, while simultaneous fluorescence (FL) detection identifies the presence of labeled markers and targets of interest. Labeled subpopulations can then be described in quantitative units of particles/mL or as a percentage of the total particles identified by side scatter.
Here, EVs derived from conditioned cell culture media (CCM) are labeled with both a lipid dye, to identify particles with a membrane, and antibodies specific for CD9, CD63, and CD81 as common EV markers. Measurements of comparison material, a concentration standard and a size standard of silica nanospheres, as well as labeled sample material are analyzed in a 1-minute analysis. The software is then used to measure the concentration and size distribution profile of all particles, independent of labeling, before determining the particles that are positive for each of the labels.
Simultaneous SS and FL detection can be utilized flexibly with many different EV sources and labeling targets, both external and internal, describing EV samples in a comprehensive and quantitative manner.

The latest generation of EV characterization tools are capable of single EV analysis across multiple parameters simultaneously. Nano-flow cytometry measures all biological particles larger than 45 nm without labeling and identifies specific characteristics of subpopulations by a variety of fluorescent labeling techniques.

Caratterizzazione di proteine transmembrana di vescicole extracellulari singole mediante citometria a nano-flusso

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...