The authors would like to thank Christina Ball&#225;zs, Hug Aubin and J&#246;rn H&#252;lsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.

NOTA: Gli esperimenti presentati in questo lavoro sono stati approvati dal Consiglio etico istituzionale dell&#39;Università di Dusseldorf. 1. Exosome Preparazione <ol><li> Raccogliere il sangue intero in 3 tubi citrato via venipuntura (totale di 9 ml). Versare il sangue in una provetta Falcon 15 ml. </li><li> Centrifugare il campione a 1500 xg per 20 min a 4 ° C per avviare la separazione delle cellule dal plasma. Trasferire il surnatante in una nuova provetta falco 15 ml. </li><li> Centrifugare il campione a 2.800 xg per 20 min a 4 ° C per rimuovere tutte le cellule dal plasma (plasma privo di cellule; CFP). Trasferire il PCP ai tubi ultracentrifugazione, 1 ml per provetta. </li><li> Centrifugare a 100.000 xg per 90 min a 4 ° C per esaurire esosomi. Togliere 900 ml di surnatante. Risospendere il pellet in restanti 100 microlitri nel tubo ultracentrifugazione. Aggiungere 900 microlitri PBS. </li><li> Centrifugare nuovamente a 100.000 xg per 30 min a 4 ° C. Togliere 900 ml di supernatant. Risospendere il pellet con i restanti 100 ml. </li><li> Trasferimento 5 a 20 ml di risospensione in 40 ml di acqua distillata. Filtrare la sospensione attraverso un filtro a 450 nm per separare exosomes da particelle più grandi. Con tale sospensione finale di misura delle particelle. </li></ol> 2. Procedura di avvio del Particle strumento di monitoraggio <ol><li> Avviare il programma facendo doppio clic sul software-icon. Clicca sulle varie schede software (&quot;Cell Check&quot;, &quot;misura&quot;, &quot;Analisi&quot;) per passare tra di loro in tutto il protocollo. </li><li> Seguire le istruzioni sullo schermo per un&#39;implementazione automatica della procedura di avvio. Selezionare le caselle di controllo, sia per la qualità delle cellule e l&#39;allineamento automatico. NOTA: Uno di questi passaggi può essere ripetuta a parte, se necessario, il tasto (A) o (B) Premendo la linguetta &quot;Controllo delle celle&quot;. </li><li> Aprire l&#39;ingresso e la porta di uscita dello strumento NTA e iniettare 10 ml acqua distillata dalla siringa nel canale della cella attraverso la porta di ingresso. Chiudere la luce di uscita come ultima quantità di acqua viene iniettata. Collocare un bicchiere sotto la luce di uscita per raccogliere soluzione di scarto. Assicurarsi che la cella di misura è priva di bolle d&#39;aria e non siringa bolle d&#39;aria nel sistema. Chiudere immediatamente la porta di ingresso. </li><li> Eseguire il controllo di qualità cella facendo clic su &quot;OK&quot;. Il software visualizza i risultati qualitativi cella dopo pochi secondi. </li><li> Se le particelle sono ancora visualizzati nella schermata live-view del software o se il risultato del controllo qualità è solo buona o cattiva, ripetere il punto 2.3 fino a quando le particelle rimanenti vengono rimossi dalla cella di misura. Ripetere anche il punto 2.3 dopo ogni misura per evitare l&#39;accumulo di particelle. Se ripetendo l&#39;iniezione di acqua distillata e controllo delle cellule non produce un risultato &quot;buono&quot;, procedere alla 2.9. </li><li> Preparare una sospensione di controllo contenente uniforme 200 pol nm dimensioniparticelle ystyrene da utilizzare per allineare i fuochi del laser e microscopio. Aggiungere una goccia della sospensione concentrata, fornita dal costruttore dello strumento, a 500 ml di acqua distillata per ottenere la concentrazione richiesta tale che 600 ± 100 particelle vengono visualizzati per schermo nel live-view. </li><li> Iniettare la sospensione allineamento nello strumento NTA come descritto al punto 2.3. Premere &quot;OK&quot; per avviare l&#39;allineamento automatico, una routine automatizzata attraverso il quale il sistema troverà automaticamente la posizione ottimale dei due fuochi. </li><li> Quando viene visualizzato un prompt che indica il sistema ora è pronto per esperimenti, fate clic su OK per avviare la misurazione. </li><li> Occasionalmente, pulire il canale della cella manualmente tra esperimenti svuotando la cella con una soluzione al 30% di etanolo. Pulire il canale ogni volta che il software viene visualizzato un rapporto di errore automatica. </li></ol> 3. Misurazione del campione <ol><li> Lavare il canale con acqua distillata prima eamisurazione del campione ch (come descritto nel passaggio 2.3). </li><li> Iniettare la sospensione exosome (preparata al punto 1) per canale, come descritto al punto 2.3. </li><li> Regolare i seguenti parametri principali del software in base alle esigenze: <ol><li> Sensibilità. Al fine di trovare la gamma di sensibilità ottimale, fare clic sul pulsante &quot;numero di particelle vs Sensitivity&quot; per visualizzare una curva per particelle misurate per schermo per diversi livelli di sensibilità. Abbiamo scelto un livello di sensibilità prima della massima pendenza della curva. Un livello maggiore sensibilità permette la visualizzazione di particelle più piccole, ma aumenta anche le questioni relative al rumore di fondo. </li><li> Luminosità minima. Abbiamo scelto una luminosità iniziale di 20 per la misura exosome utilizzare questa funzione come filtro. Regolare questo parametro fino a vuoto con forza le particelle di luce-dispersione. Regolare il basso per amplificare debolmente dispersione artefatti. Variare la luminosità secondo necessità durante l&#39;esperimento. NOTA: Le particelle che leggeriScatter troppo forte sovrapposizione e possono essere esclusi dall&#39;analisi per errore. </li><li> Min e Max Size. Impostare un filtro digitale per eliminare il rumore dei pixel e dispersione indesiderata da particelle di grandi dimensioni, regolando la dimensione minima e massima. Utilizzare un intervallo di 10 a 500 pixel per la misurazione di esosomi. </li><li> Shutter. Regolare il periodo di tempo che la fotocamera è aperta a 1/300 sec. </li></ol></li><li> Vivere parametri letti fuori: <ol><li> Passare da una digitale e una vista modus analogico in qualsiasi momento cliccando sul tasto &quot;Live-immagine&quot;. </li><li> Durante l&#39;esperimento, monitorare la barra Intensity dispersione, che visualizza lo stato di saturazione del campione come indicatore colore codificato. Non analizzare exosomes se la barra di dispersione è rossa. In tal caso diluire ulteriormente il campione per evitare questo fenomeno. Se la condizione sperimentale vieta una manipolazione della sospensione del campione, down-regolare la sensibilità o up-regolare la luminosità nel software-smpostazioni per migliorare i risultati della misurazione. NOTA: Quando si analizzano campioni con una altissima concentrazione di particelle della dispersione si fondono singole particelle e sono contati come una singola particella. </li><li> Si noti il ​​numero di particelle contate nel campo visivo dal display. </li></ol></li><li> Fare clic sulla scheda &quot;Misura&quot;. </li><li> Scegliere le impostazioni della matrice &quot;opzioni di esecuzione&quot;. <ol><li> Prima di ogni acquisizione, selezionare &quot;movimento di controllo &#39;per un controllo ripetuto di prova della deriva delle particelle. Eseguire il test almeno una volta prima di iniziare l&#39;intera analisi. Se la deriva è superiore a 20 um / sec, attendere prima di continuare la misura in modo che il campione non scorre. </li><li> Selezionare il numero di esperimenti (5) e il ritardo di tempo tra loro (0). </li><li> Eseguire un &quot;controllo a campione &#39;, se necessario. Questo test è parte dell&#39;allineamento automatico nella procedura di avvio e può essere ripetuto in seguito come necessario. </li&gt; </ol></li><li> Infine, fare clic sul pulsante &quot;acquisizione video di funzionare&quot;. Nella nuova finestra, definire il numero di cicli (15) e il numero di posizioni di misura (11). NOTA: La testa laser e il microscopio può essere spostato per analizzare il numero di particelle a 11 posizioni diverse. Secondo la richiesta sperimentale, decide se l&#39;esperimento deve essere eseguita su una posizione singola o su posizioni diverse. <ol><li> Confermare la durata minima di tempo una particella deve essere rintracciato da contare come una singola particella, impostando la risoluzione video (basso). Una risoluzione inferiore a una durata più breve inseguimento. </li><li> Selezionare un nome-file e fare clic su &quot;OK&quot; per avviare la misurazione. </li></ol></li></ol> 4. Interpretazione dei risultati <ol><li> Guarda i seguenti risultati ei parametri visualizzati dopo la misurazione sulla scheda &quot;risultati&quot;: (1) il numero totale di particelle tracciato, (2) numero medio di parteicles per la posizione, e (3) la concentrazione di particelle. <ol><li> Visualizzare la tabella media risultato del rapporto numerico delle dimensioni delle particelle (diametro, di superficie e volume) alla percentuale di numeri di particelle, nonché i valori di media e differenziazione standard. </li><li> Utilizzare la tabella di analisi di picco se più di un picco esiste nella analisi grafica. Questa tabella mostra la distribuzione di particelle di dimensioni inferiori al primo o rispettivamente secondo picco. </li></ol></li><li> Guarda il grafico calcolato dopo la misurazione di vedere una distribuzione delle particelle in base alle dimensioni. Utilizzare le icone in modalità di visualizzazione e sopra il grafico per modificare le impostazioni. </li></ol>

<ol>
	<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.+.">Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. .</a> Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. , e3037 (2012).</li><li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles.">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li><li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy.">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li><li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+presenting+cell+derived+exosomes,+based+on+immuno-magnetic+isolation+and+flow+cytometry.">Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry.</a> Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).</li><li>Carr, B., Warren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Company+profile:+NanoSight:+delivering+practical+solutions+for+biological+nanotechnology.">Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology.</a> Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).</li><li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> International immunology. 17, 879-887 (2005).</li></ol>

This work was supported by the institutional funds of the Dept. of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, HHU. The publication costs of this study were provided by Particle MetrixGmbH.

Dimostriamo un protocollo dettagliato per l&#39;isolamento exosome dal sangue e presente tracciamento nanoparticelle come un romanzo e metodo innovativo per misurare le dimensioni exosome e concentrazione in un fluido biologico. Negli esperimenti presentati sangue periferico umano è stato utilizzato come origine dei esosomi. Tuttavia, altre origini, quali urina, espettorato, supernatante di coltura cellulare, ecc, possono essere utilizzati anche come materiale di prova. Sulla base della variabilità biologica di concentrazione exosome negli esseri umani, test di diversi individui possono caratterizzato da una notevole variabile concentrazione di esosomi. Tuttavia, la concentrazione di particelle nella sonda di test biologico può avere un impatto sui risultati. Pertanto, è necessario un approccio affidabile e standardizzato per la diluizione di sonde. Nel metodo presentato exosome contenente plasma è generato da 9 ml di sangue intero periferico. Utilizzando centrifugazione differenziale passaggi un pellet exosome stato isolato da1 ml di plasma e risospeso in 5 ml di acqua distillata per portare nel campione di lavoro di esosomi sospesi. Questa impostazione predefinita ci ha fornito una corretta concentrazione di particelle, cioè, intensità scatter appropriato durante NTA. Accanto all&#39;aspetto volume e diluizione, la composizione delle soluzioni che vengono utilizzati è anche di importanza. Abbiamo usato l&#39;acqua distillata per la finale risospensione di esosomi. Naturalmente, possono anche essere utilizzati diversi supporti per la fase di diluizione finale, secondo le esigenze del set-up sperimentale. Tuttavia, nel caso di misure potenziali zeta di ionici-solutions, soprattutto nelle prove campioni con una capacità tampone, una diluizione prudente condizioni liberi turbolenza è utile. Per il confronto diretto di più campioni si consiglia di mantenere lo stesso livello di diluizione per tutti i campioni. Tutte le impostazioni, tranne la sensibilità e la risoluzione video possono essere modificate in seguito utilizzando il software di analisi ZetaView. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Sebbene gli autori ritengono che il sistema introdotto qui rappresenta attualmente lo strumento più idoneo, non è l&#39;unico sistema NTA disponibili. Una serie di studi precedenti hanno impiegato altri sistemi che applicano gli stessi principi NTA ma forniscono un altro disegno strumento che va di pari passo con alcune caratteristiche diverse 10. Riteniamo che gli aspetti pratici relativi alla manipolazione del campione e la riproducibilità dei risultati sono di importanza centrale nella scelta della sequenza metodologica per la valutazione exosome. Riteniamo inoltre che un sistema di rilevamento ideale dovrebbe eliminare i fattori dall&#39;utente a seconda che possono interferire con i risultati delle misurazioni. L&#39;approccio di analisi exosome che viene presentato qui soddisfa il criterio di maneggevolezza per un alto grado. Come ulteriore vantaggio, l&#39;analisi semiautomatica dei campioni viene eseguita in un processo rapido, generando risultati in breve tempo. Una visualizzazione online esosomi aiuta l&#39;analizzatore di gain un&#39;idea istante delle caratteristiche exosome, ad esempio, la concentrazione lordo. Un semplice ma elegante aggiunta alla tecnica di misura qui presentato è l&#39;uso di anticorpo marcato exosomes e la cattura del fascio laser diffusa utilizzando un filtro precedente davanti al rivelatore. In questo modo sottopopolazioni exosome si distinguono in base alla loro antigeni di superficie e altre caratteristiche biologicamente rilevanti tecnicamente accessibili a una colorazione fluorescente selettiva. Uno svantaggio della versione corrente del nostro strumento di monitoraggio delle particelle è il fatto che a livelli molto elevati di sensibilità manufatti come rumore di fondo possono diventare presente, che si basa sulla parete di canale della cella. Una soluzione tecnica e miglioramento del sistema attuale possono essere disponibili in un prossimo futuro. Con questo metodo le riflessioni della luce dispersione laser sulla parete del canale sarà ridotto, aumentando così<html> la precisione dei segnali misurati ei dati ottenuti e l&#39;abbassamento del limite di rilevabilità. Sebbene il protocollo attualmente utilizzato per l&#39;isolamento exosome è ben consolidata e lo strumento particle tracking applicato ha una risoluzione notevolmente preciso con una distribuzione di dimensione inferiore a 30 nm, non c&#39;è garanzia che le particelle rilevate sono infatti del tutto veri exosomes. Altre particelle, come frammenti di cellule morte o grandi complessi proteici possono anche essere presenti nella sospensione exosome e portare a segnali falsi positivi. Un metodo affidabile per cui tale &quot;inquinamento&quot; può essere escluso può essere microscopia elettronica (EM), sia EM trasmissione o scansione EM. Purtroppo, nessun indicatore generale e specifico per esosomi è stato identificato finora, anche se un certo numero di marcatori di superficie proposti in precedenza hanno acquisito una crescente quantità di attenzione, tra cui tetraspanine (tspan), CD81, C63, CD9, ecc 11. &quot;&gt; A prescindere dal futuro progresso della ricerca sulla biologia exosome, soprattutto per quanto riguarda gli indicatori specifici exosome, il protocollo che viene qui presentata fornisce un potente metodo per l&#39;isolamento e la rilevazione di esosomi. Concentrazione e dimensioni possono essere facilmente determinato in un assistito software- modo semplice. L&#39;aggiunta di marcatori fluorescenti selettivi o anticorpi fluoroforo accoppiato probabilmente migliorare ulteriormente le possibili applicazioni del metodo presentato di NTA.

L&#39;esatta funzione di exosomes circolanti rimasto sconosciuto per un lungo periodo di tempo. Anche ora il meccanismo percorso completo di esosomi non è del tutto chiaro. Dal esosomi portano antigeni, proteine ​​e RNA (mRNA e miRNA), che li riferisce alla loro cella genitori di origine, la loro funzione come trasmettitori di segnalazione cellula-cellula è principalmente stata data la priorità. Molti metodi differenti sono stati descritti in letteratura per l&#39;isolamento e la determinazione quantitativa di esosomi 1,2. Tuttavia, nessun consenso su un &#39;gold standard&#39; è stato raggiunto. Nel frattempo la maggioranza degli scienziati attivi nel campo della ricerca exosome concordano che un metodo coerente di isolamento è altamente giustificato per raggiungere un grado di comparabilità tra i diversi rapporti e studi più elevato. Fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) è lo strumento più comune e diffusa per l&#39;analisi exosome 3. FACS ha benEFIT che, tramite l&#39;etichettatura di fluorescenza, le cellule di diversa provenienza possono essere confrontati in un solo passo. I principali svantaggi di FACS sono che questo metodo non è abbastanza sensibile per identificare le particelle inferiori a 0,5 micron 4, considerando exosomes sono generalmente compresi tra 30-120 nm di diametro 5, ancor meno per misurare le loro dimensioni. Microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono altri strumenti per l&#39;analisi della dimensione delle particelle e la morfologia di esosomi. Tuttavia, sia SEM e TEM hanno lo svantaggio che la preparazione dei campioni è, entrambi i metodi coinvolgono fasi intensità di lavoro che richiede tempo e ciascuno ha un certo rischio di generazione manufatto. Né metodo è adatto per un&#39;elevata produttività e caratterizzazione di diverse migliaia di singole particelle di un campione. Inoltre, un&#39;analisi quantitativa per clinica routine in cui i campioni devono spesso essere analizzati simultaneamente o almeno in un periodo molto breve èdifficile da eseguire. Tecniche di nuova generazione permettono ora di analizzare esosomi senza un intenso lavoro preparatorio prima (SEM esempio, ambientale). Queste tecniche moderne sono ancora piuttosto scomodo per l&#39;analisi di grandi volumi contenenti sospensioni esosomi per determinare il loro numero medio e distribuzione delle dimensioni 6. Un altro metodo molto sensibile per la visualizzazione e l&#39;analisi di esosomi è-nanoparticelle tracciamento analisi (NTA). Questo metodo sfrutta due diversi principi di fisica. In primo luogo, le particelle vengono rilevati dalla luce dispersa quando vengono irradiate con un raggio laser. Il secondo fenomeno è noto come moto browniano, secondo cui la diffusione di particelle differenti in una sospensione liquida è inversamente proporzionale alle loro dimensioni. In quest&#39;ultimo caso il movimento dipende anche dalla temperatura e dalla viscosità del liquido. Tuttavia, questo tasso è direttamente correlata alla dimensione delle particelle ed è utilizzato da NTA. Utilizzando morbidoanalisi basata-ware, immagini digitali di luce diffusa da singole particelle sono registrati. Piazzole di punti luce sparsi e la loro velocità di movimento forniscono dati che facilitano la determinazione del conteggio particellare totale e distribuzione delle dimensioni. Questa tecnica è particolarmente potente per analizzare particelle con un diametro medio inferiore a 100 nm. Le dimensioni e la concentrazione misurazioni vengono effettuate con il ZetaView browniano e elettroforesi Motion Video Analysis microscopio. Si tratta di un banco di top nanoparticella strumento di analisi semi-automatico per campioni liquidi (di seguito denominato strumento di monitoraggio di particelle). Consiste dell&#39;analizzatore particle tracking e un computer portatile con il software utilizzato per l&#39;analisi dei dati. Campioni biologici eterogenei sono adatti per questo metodo come sospensioni più omogenei di particelle inorganiche. Un microscopio laser scattering con una videocamera viene utilizzata per il rilevamento di particelle e per la observation del loro movimento. Mentre l&#39;asse orizzontale e microscopio è concentrata nel canale cella riempita con una sospensione contenente esosomi, il raggio laser è orientato verticalmente. Le particelle irradiate dalla dispersione laser la luce, che viene registrata meno di 90 ° da una videocamera digitale attraverso il microscopio (Figura 1). L&#39;intensità della luce diffusa consente l&#39;osservazione di particelle più grandi di 60 nm di diametro. In una tale impostazione di luminosità di una particella non è l&#39;unica indicazione della dimensione delle particelle. Quando viene applicato alcun campo elettrico, il movimento delle particelle segue solo moto browniano e può servire come indicatore per il calcolo delle dimensioni delle particelle. Tuttavia, lo strumento è in grado di applicare un campo elettrico attraverso il canale della cella. Quando sono sottoposti a questo campo, il potenziale, polarità e livello di ionica-carica delle exosomes sospesi diventano ulteriori determinanti della direzione del loro movimento. Velocità e direzione risultato in un mo elettroforeticobilità istogramma. Mentre trovare un metodo ottimale per analizzare exosomes isolato è un problema, un altro sta nella effettiva isolamento di exosomes di diversi mezzi, come sangue, ascite, urina, latte, liquido amniotico o supporto cellulare. Sono stati descritti finora metodi diversi, che si basano su ultracentrifugazione 1, reagenti di separazione industriali (come Exoquick) 7, sfere magnetiche per l&#39;antigene che impiegano la separazione 8 o ultrafiltrazione passi 9. In questo protocollo dimostriamo l&#39;intero processo di isolamento exosome via ultracentrifugazione e mostrare come analizzare il exosome conseguente sospensione contenente attraverso lo strumento di monitoraggio delle particelle. Sono fornite considerazioni specifiche per l&#39;analisi delle medie plasma o coltura cellulare umana esosomi derivati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>364305</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Distilled water</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3880087</td>
			<td>Aqua ad iniectabilia</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td>PP Tube, Steril 15ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifugation tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357448</td>
			<td>Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybead</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>07304</td>
			<td>2,6% Solids-Latex 
			Alignment Solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (Filter)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (ZetaView)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606051V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td>BD Blunt Fill Needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16555</td>
			<td>Syringe filter, hydrophilic, 450&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material Name&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>L8-M</td>
			<td>Rotor: 70Ti Ser. No E21078</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>PMX 100, Type 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Rotor: A-4-44</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative method for exosome quantification and size measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

Il campione utilizzato per questa dimostrazione mostra un ambiente ottimale per la misura con una sensibilità del 85%, prima della massima pendenza della curva di sensibilità (Figura 2). La luminosità, il min / max valori sono stati scelti come raccomandato nel protocollo. Una concentrazione di 5,3 particelle / ml x 10 6 è stata misurata, mentre la dimensione media delle particelle era 0,149 micron, la maggior parte erano 0,137 micron. I valori ricevuti dopo la misurazione possono essere salvati in un report con un formato di file .pdf o come .txt per l&#39;esportazione in un database. Il grafico può essere regolata a piacere, come descritto nel protocollo (sezione 4). La sequenza video viene inoltre memorizzato e può essere utilizzato per più tardi off-line rianalisi. Tuttavia, in tale analisi off-line, le impostazioni pre-acquisizione della fotocamera non possono essere modificate con effetto retroattivo. Per trovare le impostazioni dei parametri ottimali per una misura, noi qui descriviamo the ottimizzazione delle impostazioni dello strumento sulla esempio di un formato di polistirene standard 100 nm. L&#39;influenza di due parametri, sensibilità e min / max dimensioni sull&#39;immagine video e granulometria distribuzione è discusso in dettaglio. Tutti gli altri parametri sono riassunti in Tabella 1. Una impressione visiva dell&#39;impatto della sensibilità (da 50 a 94) sulle immagini analogiche e digitali è visualizzato in Figura 3. Le informazioni quantitative derivate dalle immagini è presentato nella Figura 4, in base alle impostazioni della Tabella 1, Dimensione min = 5 e Max Size = 200. Un tipico rapporto del numero di particelle rilevate vs sensibilità è mostrato in Figura 4A. Tra 50 e 90, il numero di particelle rilevate aumentato con sensibilità e aumentato drammaticamente per sensibilità&gt; 90. È stato trovato un intervallo ottimale di sensibilità tra 66 e 86 (A). Granulometrie ottenuti con difimpostazioni di sensibilità ferenti sono illustrati nella Figura 4B. Le distribuzioni granulometriche rappresentano la media di tre misurazioni individuali. Per troppo bassa sensibilità (sensibilità = 62, curva rossa) sono stati analizzati solo poche particelle causando statistiche piuttosto poveri. Il numero di particelle analizzati aumentata con sensibilità e raggiunto un ottimale tra 70 (curva gialla) e 86 (curva tan). Aumentando ulteriormente il vantaggio sensibilità ad un deterioramento della distribuzione granulometrica con il numero di particelle che cadono e distribuzione dimensionale spostamento verso dimensioni più piccole (sensibilità = 94, curva blu). La figura 4C mostra l&#39;andamento del diametro x50 basato sul numero (50% particelle sono più piccole di questo diametro) in funzione della sensibilità. Nell&#39;intervallo beige, l&#39;RSD delle dimensioni delle particelle è inferiore all&#39;8% e corrisponde all&#39;intervallo ottimale in A. Le regioni rosse indicano RSD&gt; 8% a causa di statistiche poveri (sensibilità troppo bassa) o ampia distributi con spostamento verso dimensioni più piccole (sensibilità troppo alta). Le impostazioni di Dimensione min e Max Size sono filtri applicati alle immagini digitali, al fine di rimuovere le particelle di dimensioni inferiori a pronti Dimensione min e più grandi di Max Size. Grazie alla capacità di diffondere la luce, una particella crea un punto di una certa dimensione in una immagine digitale. La dimensione dello spot è misurato come numero di pixel (px). Quando una particella diffonde la luce molto bene (ad esempio, particelle&gt; 200 nm o inerti), la dimensione del punto è abbastanza grande, ad esempio,&gt; 500 px. La dimensione del punto è piuttosto piccola (ad esempio, &lt;10 px) per le piccole particelle (ad esempio, &lt;20 nm) a seconda del materiale particellare. Dimensioni Spot (px), non può essere scambiato con granulometria (nm), in quanto non sono identici e non vi è alcun rapporto diretto tra queste due variabili. Un&#39;ottimizzazione di Min e Max Size permette all&#39;utente di filtrare gli oggetti indesiderati come agglomerati (Dimensione massima) o piccolooggetti come rumore di fondo (Dimensione min). L&#39;influenza di Min / Max Size sulla distribuzione delle dimensioni delle particelle di dimensioni standard 100 nm è mostrato in Figura 4D (sensibilità = 82). Quando l&#39;intervallo è impostato su piccoli formati in loco (ad esempio, min = 1, max = 52; curva arancione), il numero di particelle analizzate si riduce e il diametro x50 basato numero è leggermente spostata verso dimensioni più piccole. Un ambiente per le macchie più grandi (min = 40, max = 1.000; curva rossa) si traduce in una vasta distribuzione granulometrica spostata verso formati più grandi. Al fine di ottenere la parità di numero totale di particelle, i confini di intervallo delle distribuzioni sia arancione e rosso sono stati adeguati in base 80 particelle. La distribuzione con le impostazioni ottimali (min = 5, max = 200; curva tan) è composto da 360 particelle. Una serie di esperimenti sono stati eseguiti con successo esosomi isolato mediante ultracentrifugazione e misurati da NTA utilizzando il sistema presentato. I dati risultanti erano altamentecoerente e confermato un elevato livello di riproducibilità. Altri metodi di isolamento dovrebbe mostrare risultati simili. Tuttavia, la fase di diluizione è stato identificato come un passo particolarmente critico e il suo impatto sul numero totale calcolato di particelle deve essere rivalutato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> Figura 1. Schema del setup della NTA. L&#39;asse microscopio / video e laser sono orientati ortogonalmente tra loro, attraversano la sezione trasversale canale della cella. Luce diffusa dalle particelle viene visualizzato nella finestra &quot;live-view&quot; del software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Numero di particelle vs curva di sensibilità. Il numero di particelle vs curva di sensibilità mostra le particelle in una posizione in un momento durante una scansione automatica della sensibilità. Questa visualizzazione grafica viene utilizzata per determinare le migliori preferenze per le misurazioni iniziali. Un valore di sensibilità viene scelto prima alla massima pendenza del grafico. E &#39;importante ricordare che gli artefatti non sono eliminati in questo esperimento di prova e possono influenzare il grafico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> Figura 3. Impatto di sensibilità da analogico e digitale delle immagini. Visualizzazione di particelle sullo schermo live view viene visualizzato per sensibilità tra 50 e 94 sia analogica (riga in alto) und vista digitali (fila in basso). Quando la sensibilità è troppo bassa, solo poche particelle vengono rilevati (a sinistra). Alla sensibilità ottimale le particelle appaiono come singoli punti e isolati gli uni dagli altri (al centro). A un relativamente elevati particelle sensibilità si fondono portando ad una scarsa qualità dell&#39;immagine (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> Figura 4. Influenza delle impostazioni di dimensione max sensibilità min e per un campione di controllo di 100 nm polistirolo particelle (A) Trama di sensibilità in funzione del numero rilevato di particelle.; l&#39;intervallo ottimale è 66-86, prima della massima pendenza della curva. Distribuzioni (B) dimensione delle particelle ottenute con diverse impostazioni di sensibilità (62-94); grafici per troppo bassa (62) o troppo alto (94) sensibilità non catturano la distribuzione delle dimensioni delle particelle per il campione di controllo polistirene 100 nm. (C) Numero basato diametro x50 contro sensibilità; l&#39;errore di x50 nell&#39;intervallo beige è inferiore a 8%, intervallo ottimale è da 66 a 86. (D) Effetto Min e Max Size sulla distribuzione delle dimensioni delle particelle; parametri ottimali (min = 5 e max = 200) catturano la distribuzione corretta per il campione di controllo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Parametri pre-acquisizione </td></tr><tr><td> Sensibilità </td><td> variabile </td></tr><tr><td> Otturatore </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Frame rate </td><td> 30 fps </td></tr><tr><td> Risoluzione </td><td> Ciaogh </td></tr><tr><td> Cicli </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Più Acquisizioni </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Posizione </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Parametri post-acquisizione </td></tr><tr><td> Min Luminosità </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Max Size </td><td> variabile </td></tr><tr><td> Min Size </td><td> variabile </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Sintesi dei parametri pre e post-acquisizione per l&#39;impostazione dello strumento di monitoraggio delle particelle.

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An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

an-innovative-method-for-exosome-quantification-and-size-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

30.7K Views.  Heinrich-Heine-University Dusseldorf. A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Metodo per la misurazione di Cinetica fusione virale a livello di singola particella

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Ricerca

Biologia

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &amp;ldquo;Green&amp;rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

Flusso tangenziale Ultrafiltrazione: un metodo &quot;verde&quot; per la selezione del formato e la concentrazione di nanoparticelle di argento colloidale

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: un plugin per ImageJ semi-automatico di misurazione Leaf Shape

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Un metodo di immunofluorescenza per la caratterizzazione di cellule esofago di Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Un metodo facile per piante polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. Three-dimensional (3D) cell culture techniques are a recent innovation developed to address the shortcomings of adherent cell culture. While several techniques for generating tissue analogues in vitro have been developed, these methods are frequently complex, expensive to establish, require specialized equipment, and are generally limited by compatibility with only certain cell types. Here, we describe a rapid and flexible protocol for aggregating cells into multicellular 3D spheroids of consistent size that is compatible with growth of a variety of tumor and normal cell lines. We utilize varying concentrations of serum and methyl cellulose (MC) to promote anchorage-independent spheroid generation and prevent the formation of cell monolayers in a highly reproducible manner. Optimal conditions for individual cell lines can be achieved by adjusting MC or serum concentrations in the spheroid formation medium. The 3D spheroids generated can be collected for use in a wide range of applications, including cell signaling or gene expression studies, candidate drug screening, or in the study of cellular processes such as tumor cell invasion and migration. The protocol is also readily adapted to generate clonal spheroids from single cells, and can be adapted to assess anchorage-independent growth and anoikis-resistance. Overall, our protocol provides an easily modifiable method for generating and utilizing 3D cell spheroids in order to recapitulate the 3D microenvironment of tissues and model the in vivo growth of normal and tumor cells.

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Istituzione di un pH extracellulare acido sistema cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.