La natura complessa delle EV rende difficile riconoscere la sottopopolazione di interesse e questo protocollo può rilevarle con il loro fenotipo, profilo dimensionale e proprietà nanomeccaniche. Questa combinazione di tecnica è un metodo label-free, che ci consente di rilevare EV in tempo reale dai mezzi di condizione e dal plasma sanguigno. Questa tecnica consente di caratterizzare profondamente sottoinsiemi di nanoparticelle di interesse, al fine di essere utilizzate come bioindicatori di patologia, o anche utilizzate come nanoparticelle per la somministrazione di farmaci.
Poiché si tratta di un metodo molto sensibile, è imperativo prestare attenzione alla preparazione del biochip prima di iniettare il campione di interesse. Dopo aver rivestito e funzionalizzato i chip, incubare il biochip in una miscela di 200 millimolari di etile dimetilamminopropilcarbodiimide/N-idrossisuccinimide e 50 millimolari per litro di N-idrossisuccinimide per almeno 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Utilizzando lo spotter, aggiungere 300 nanolitri di soluzione di ligando e incubare il biochip sotto un bagno sonico per 30 minuti.
Lavare il biochip dall'alto con acqua ultrapura. Aggiungi una goccia di olio con lo stesso indice di rifrazione del prisma per creare uno strato sottile uniforme tra il biochip e il prisma e posizionalo delicatamente su un prisma con lo stesso indice di rifrazione del biochip. Per la risonanza plasmonica di superficie, montare il biochip sul sistema SPRi.
Vai al menu a discesa sul lato sinistro del software e fai clic sulla directory di lavoro. Trova l'immagine in cui sono visibili diversi punti e fai clic per selezionare questa immagine. Quindi scrivi il nome delle famiglie di liganti e fai clic sulla definizione di specie Finish.
Trascinare la linea nera con il cursore sull'angolo di lavoro ottimale. Fate clic su Sposta specchia su angolo di lavoro e selezionate un angolo di lavoro. Ora fai clic su Kinetics.
Poiché il software richiede all'utente di definire il controllo negativo, scegliere Nessun controllo negativo a questo punto. Iniettare albumina sierica di ratto a 50 microlitri al minuto per quattro minuti. Iniettare etanolammina a 20 microlitri al minuto per 10 minuti per disattivare i gruppi carbossilici ancora presenti e reattivi sulla superficie.
Successivamente, lavare il biochip iniettando 40 millimolari OG a 50 microlitri al minuto per quattro minuti. Iniettare le vescicole extracellulari ad una concentrazione specifica sul chip biofunzionalizzato seguendo la cinetica dell'interazione delle vescicole sui diversi punti, contemporaneamente. Determina anche il valore della riflettività e il livello di interazione.
Una volta stabilizzato, iniettare glutaraldeide sul chip per fissare le vescicole extracellulari nel punto in cui si trovano prima di eseguire l'imaging AFM. Allineare il biochip sulla parte superiore della maschera sul vetrino. Utilizzare la telecamera CCD sulla parte superiore dell'AFM per localizzare il cantilever nel punto corretto che deve essere scansionato.
Avviare l'acquisizione AFM in modalità di contatto da tre a cinque aree grandi e piccole. Quindi, trattare le immagini AFM con il software di elaborazione dati JPK selezionando prima il canale di altezza. Scegliere un adattamento polinomiale da sottrarre da ogni linea per ottenere linee di scansione raddrizzate.
Selezionate la soglia di altezza sui grani d'oro per eliminare la rugosità sulla superficie. Il modulo di estrazione dei grani segna i grani utilizzando una soglia di altezza di 8,5 nanometri. I biochip multiplexed sono stati analizzati dopo la passivazione dell'albumina.
Il chip senza default. Il chip con alcuni difetti, dovuti alla fusione di macchie, innesti deboli, o bolle o contaminanti. E viene mostrato un chip d'oro nudo senza microarray per esaminare l'adsorbimento di vescicole extracellulari sull'oro.
L'esperimento di cattura su un biochip multiplex ha mostrato buoni segnali di riflettività per diversi ligandi e un buon rapporto segnale-rumore per i diversi ligandi, poiché la risposta del controllo negativo era trascurabile. L'adsorbimento delle vescicole extracellulari dopo l'iniezione del campione di vescicola extracellulare ha mostrato un segnale di alta riflettività, suggerendo che quelle vescicole erano in grado di adsorbire e rimanere stabili sul chip d'oro. Dopo il carico di vescicole extracellulari, sono state generate le immagini AFM su larga e piccola scala delle vescicole extracellulari su biochip.
Una visione ravvicinata ad alta risoluzione consente la metrologia delle vescicole extracellulari. Il diametro effettivo delle vescicole extracellulari su un biochip variava da 30 a 300 nanometri, con una grande maggioranza intorno ai 60 nanometri. I risultati ottenuti in aria e liquido sono stati comparabili.
Lo spettro Raman delle vescicole extracellulari adsorbite su un chip nudo ha rivelato uno spettro chiaro, con picchi corrispondenti principalmente alle vibrazioni del metilene, che sono associate ai lipidi delle membrane delle vescicole extracellulari. È importante preparare rigorosamente il biochip per essere in grado di rilevare i veicoli elettrici in modo accurato e riproducibile. Metodi convenzionali come il Western blotting e l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle possono essere utilizzati per correlare e confermare fenotipi e modelli di dimensioni.
Inoltre, sono previste analisi multiomiche per approfondire ulteriormente la caratterizzazione molecolare delle EV e la potenziale discriminazione dei sottoinsiemi.
