Questo protocollo fornisce un sistema economico e adattabile per valutare la dinamica temporale degli spunti fluorochimici sulle fiornie di Colletotrichum e su altri agenti patogeni vegetali che infettano il termine fioritura. I nuovi dispositivi di raccolta dell'acqua piovana per pavimenti consentono all'utente di monitorare stimolanti naturali e condizioni che influenzano lo sviluppo di agenti patogeni in modo quasi reale specifico del sito. Iniziare questa procedura con una cultura di Colletotrichum fiorniae da un host naturalmente infetto come descritto nel protocollo di testo.
Quando le colonie iniziano a sporularsi, striature di conidia su un altro agar V 8 Juice contenente piatto di coltura cellulare per produrre una coltura sporulante ad alta densità. Dopo sette giorni di crescita, utilizzare un ciclo sterile standard per raccogliere una piccola quantità di conidia dalla coltura ad alta densità toccando leggermente l'anello alla massa conidiale. Mescolare questo in un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente 10 millilitri di acqua deionizzata sterile.
Vortice questo campione per 10 secondi. Utilizzando una pipetta standard, immergersi su e giù numerose volte per mescolare ulteriormente il campione. Quindi posizionare una goccia del campione a vortice sull'emocitometro e stimare le concentrazioni di spore.
Regolare la concentrazione a 0,1 milioni di conidia per millilitro di acqua distillata sterile con un volume finale di cinque millilitri. Questa è indicata come sospensione delle spore e viene effettuata solo immediatamente prima dell'uso in entrambi i test bio. Per eseguire l'estrazione floreale a base di cloroformio, pulire due volte tutti i componenti con il 95% di etanolo.
Quindi pulire i componenti due volte con cloroformio per prevenire la contaminazione per ogni estrazione. Non pulire i tappi rivestiti in PTFE con cloroformio in quanto li danneggerà. Dopo la pulizia, mettere da parte i componenti per asciugare a testa in giù.
Unire una parte di fiori lavorati a nove parti cloroformio in un becher aggiungendo fiori e quindi cloroformio. Ruotare delicatamente per 30 secondi e filtrare attraverso uno schermo in acciaio inossidabile nel secondo becher. Versare l'estratto a base di cloroformio dal secondo bicchiere nel tubo di coltura del vetro e apporre il cappuccio PTFE.
Avvolgere il cappuccio con parafilm per evitare l'evaporazione. Conservare l'estratto floreale a base di cloroformio risultante nell'oscurità per ridurre la degradazione della luce a quattro gradi Celsius fino all'uso sperimentale. Ripetere le estrazioni con più campioni per fornire repliche.
Per creare un dispositivo di raccolta per ogni posizione selezionata, utilizzate un bit di passo collegato a una pressa di perforazione per praticare un foro nella parte inferiore di una tazza di spruzzo. Quindi tagliare una linea retta dalla parte superiore del foro alla bocca della tazza spray. Ora pratica quattro fori equidistanti abbastanza grandi da infilare il filo rivestito di plastica alla bocca della tazza di spruzzatura.
Fissare un'estremità dei fili rivestiti di plastica lasciando un'estremità libera. Praticare un foro abbastanza grande da infilare lo spray per vernice o l'adattatore per tazze in un coperchio del cappuccio della centrifuga da 50 millilitri. Sigillare i fili dell'adattatore con parafilm per evitare perdite.
Attaccare questo sia al tappo di centrifuga che alla porzione filettata della tazza dello spruzzatore. Quindi attaccare il tubo di centrifuga accoppiato da 50 millimetri. Creare quattro dispositivi di raccolta per posizione di campionamento.
Distribuisci i dispositivi in luoghi selezionati flettendo le tazze spruzzatori per adattarlo agli steli. Orientare il lato tagliato della tazza dello spruzzatore verso l'alto utilizzando i fili rivestiti di plastica attaccati ad altri steli. Ciò garantisce che l'acqua che passa sopra i fiori sia catturata.
Per raccogliere l'acqua piovana dai fiori di mirtillo rosso, prima puntura di calore otto fori equidistanti intorno alla bocca dell'imbuto usando una sonda metallica. Inserire le fascette di torsione in quattro dei fori. Attaccare le altre estremità alla posizione opposta di quel foro formando un modello di incrocio pulito.
Avvolgere l'imbuto a vapore con parafilm e mettere da parte. Praticare un foro abbastanza grande da inserire lo stelo incanalato in un tappo di centrifuga da 50 millilitri con un bit a gradini. Inserire l'imbuto preparato nel cappuccio della centrifuga.
Dopo le precipitazioni o l'irrigazione aerea, rimuovere e sostituire la porzione del tubo inferiore del tubo di centrifuga. I tubi di raccolta dell'acqua piovana devono essere cambiati rapidamente dopo aver bagnato gli eventi in quanto sono soggetti a degradazione da contaminanti naturali mobilitati nel deflusso come batteri e altri funghi. Posizionare due strati di dischi di carta all'interno di piatti di coltura e immergere con due millilitri di acqua distillata sterile.
Quindi, mescolare volumi uguali di acqua distillata sterile ed estratto floreale a base d'acqua in due tubi di microcentrifugo millilitro. Quindi aggiungere un volume uguale della sospensione spore ai due tubi di microcentrifugo a millilitro preparati. La preparazione risultante è indicata come una miscela di trattamento acquoso.
Per il controllo, omettere la porzione di estratto floreale e sostituire con acqua distillata sterile per mantenere coerenti le concentrazioni conidiali. Ora posiziona le copertine di vetro pre-pulite sopra gli asciugamani di carta imbevuti all'interno del piatto di coltura cellulare. Posizionare una goccia da 40 microliter di miscela di trattamento acquoso al centro di un coverslip.
Ripetere questa situazione per i trattamenti desiderati, incluso il controllo. Quindi chiudere il piatto di coltura cellulare. Una volta che tutti i trattamenti e le repliche sono stati dispensati, posizionare tutti i piatti di coltura cellulare replicati in un contenitore di plastica sigillato e incubare a 25 gradi Celsius al buio.
Nei punti di tempo predeterminati, aggiungere 10 microlitri di un fissatore alle goccioline che fermano la crescita e semiconservano il supporto. Una volta aggiunto un fissatore, invertire attentamente i copripavimenti posizionando ciascuno di essi lato goccia su uno scivolo al microscopio di vetro per facilitare l'esame microscopico. Quando tutte le coverlips sono sugli scivoli del microscopio di vetro, lasciarle depositare e parzialmente asciugare nel cappuccio di flusso per 20 minuti.
Conta tutte le conidie presenti sul coverslip tra cui conidia primaria, conidia germinata e conidia secondaria appena formata, così come appressoria. Lavorare a 400 volte l'ingrandimento o 200 volte per un'area di 3.808 millimetri quadrati. In una cappa a flusso laminare, aggiungere due volumi uguali di acqua distillata sterile e un volume di sospensione di spore a un tubo microcentrifugo a due millilitri.
Mettere da parte questa miscela di trattamento acquoso per i biosaggi di estratto floreale a base di cloroformio. In una cappa aspirante, posizionare una cella Van T su una coverlip di vetro all'interno del piatto di coltura delle cellule di plastica preparato. Erogare 33 microlitri di estratto floreale desiderato a base di cloroformio al centro della cella e lasciare asciugare.
Non toccare le pareti della cella. Per il trattamento di controllo, aggiungere cloroformio vergine. Una volta che l'estratto floreale a base di cloroformio si è asciugato, erogare 99 microlitri della miscela di trattamento acquoso preparata con una pipetta standard al centro della cella Van T.
Quindi chiudere tutti i piatti di coltura cellulare e incubare. Nei punti di tempo predeterminata, aggiungere 15 microlitri di un fissatore alla cella Van T e lasciarlo riposare per almeno cinque minuti per garantire un'adeguata colorazione fungina. Dopo tale periodo, rimuovere con cura la cella Van T.
Eseguire le fasi di inversione delle copertine e acquisizione dei dati come in precedenza. Dopo una valutazione microscopica delle C.fiorniae a 24 ore dopo l'inoculazione, il confronto della conidia in presenza di acqua distillata sterile rispetto all'estratto floreale a base d'acqua rivela un drammatico aumento della conidiazione secondaria e della formazione di appressorio. Tuttavia, la conidiazione secondaria non era così evidente quando si confrontava il saggio di bioassay cloroformio controllo sterile dell'acqua distillata con estratti a base di cloroformio.
Piuttosto, la crescita della C.fiorniae si è spostata verso la formazione appressoriale. In questo saggio, un controllo sterile dell'acqua distillata e estrazioni floreali a base di cloroformio di mirtillo sono state ispezionate visivamente a zero, sei, 12 e 24 ore dopo l'inoculazione. La formazione di appressorium iniziò a sei ore nell'estratto floreale a base di cloroformio e aumentò costantemente nei successivi punti di tempo.
Questo risultato supporta la scoperta che i fiori riducono il tempo necessario per formare strutture di infezione. La gestione delle malattie per i funghi in decomposizione della frutta spesso comporta applicazioni fungicide a tempo di fioritura. Qui, estratti a base di cloroformio di mirtillo rosso da più fasi di crescita del mirtillo rosso sono stati valutati visivamente per le cere superficiali efficaci su C.fiorniae a 24 ore dopo l'inoculazione.
Le ovaie raccolte a giugno, i frutti immaturi raccolti a luglio e in agosto la frutta raccolta in ottobre e un controllo sterile dell'acqua distillata sono stati ispezionati per la formazione appressoriale. Gli estratti a base di cloroformio ovaio avevano la maggiore grandezza di formazione appressoriale che indicava l'importanza della fioritura nel ciclo di vita delle C.fiorniae. L'agente patogeno è il componente più importante di questo protocollo.
I funghi devono essere spostati regolarmente su nuovi supporti per mantenere la coerenza tra le prove. Qualsiasi lavoro con cloroformio deve essere eseguito in una cappa aspirante per motivi di sicurezza. Ciò include la preparazione di materiali e vetreria, le procedure di estrazione e la conduttanza del saggio biologico a base di cloroformio.
Combinazioni di punti temporali, agenti patogeni, raccolte floreali di acqua piovana o estrazioni ospiti possono essere utilizzate per valutare varie interazioni ospite-patogeno. I dispositivi di raccolta dell'acqua piovana e i relativi biosatti consentiranno ad altri di lavorare con stimolanti ospiti mobilitati durante gli eventi della pioggia in numerosi sistemi di percorso.
