Questo protocollo è una tecnica robusta per determinare l'integrità funzionale delle giunzioni strette intercellulari in un modello cellulare della barriera ematico-encefalica umana. Questo è un protocollo semplice e abbastanza economico che consente di calcolare l'apparente permeabilità in un periodo di tempo più breve invece di eseguire un saggio cinetico più lungo. Questo metodo può anche essere usato per determinare l'integrità funzionale delle giunzioni strette nelle cellule endoteliali cerebrali trasfette da nanoparticelle di DNA polimerico.
Per iniziare la placcatura cellulare, posizionare inserti di coltura tissutale con membrane microporose in una piastra di coltura di 24 po '. Aggiungere 400 microlitri di collagene da 0,15 milligrammi per millilitro di tipo uno in ogni inserto di coltura tissutale. Quindi incubare per un'ora in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius, 5%.
Dondolare delicatamente la piastra a 24 pozzi per consentire una diffusione uniforme della soluzione di collagene sulla membrana microporosa negli inserti di coltura tissutale. Dopo un'ora, rimuovere la soluzione di collagene e lavare delicatamente la membrana microporosa con 0,4 millilitri di tampone 1X PBS. Ora, le celle hCMEC/D3 della piastra con una densità di 50.000 celle per centimetro quadrato negli inserti cellulari.
Posizionare la piastra da 24 pozzi con la configurazione della coltura tissutale nell'incubatore per consentire l'attacco cellulare e la proliferazione. Incubare la piastra per sette giorni per consentire alle cellule di raggiungere il 100% di confluenza. Rimuovere il mezzo di crescita a giorni diversi e trasferire 0,5 millilitri di mezzi freschi prerifavosi negli inserti di coltura tissutale.
Ripetere la procedura di placcatura per l'blotting occidentale per determinare i cambiamenti nell'espressione ZO-1 per la trasfezione della nanoparticella del DNA e per il test ATP per determinare la vitalità cellulare nelle cellule trasfette. Per determinare la permeabilità apparente di Lucifer Yellow, ogni giorno dopo la semina, rimuovere il mezzo di crescita e aggiungere 1,5 millilitri di tampone di trasporto pre-riscaldato al lato basolaterale del pozzo. Ora aggiungi 58,3 microlitri di soluzione Lucifer Yellow da 20 micromolari sul lato apicico di ogni inserto trans-well.
Salvare 50 microlitri della soluzione per le misurazioni della fluorescenza. Dopo aver rimosso completamente il buffer PBS residuo dal lato apicali, aggiungere la soluzione Lucifer Yellow il più rapidamente possibile per evitare di asciugare le cellule. Garantire volumi accurati della soluzione Lucifer Yellow sul lato apicico.
Assicurati di aggiungere lo stesso e accurato volume della soluzione Lucifer Yellow in tutti gli inserti. Lavorare rapidamente per evitare di asciugare le cellule. Incubare le cellule in uno shaker a piastre rotanti a 100 giri/min e 37 gradi Celsius per 60 minuti.
Quindi rimuovere 30 microlitri del campione Lucifero Giallo da ogni compartimento apicico. Trasferire la soluzione Lucifer Yellow da 20 micromolare e i campioni laterali apicari in tubi preetichettati. Ora diluire il campione di dieci volte utilizzando il buffer di trasporto.
Rimuovere 500 microlitri da ogni compartimento basolaterale e trasferire il campione in tubi preetichettati. Prepara una serie di standard Lucifer Yellow per la curva standard. Aggiungere 100 microlitri di ogni campione standard apicale e basolaterale ad ogni pozza di una piastra nera da 96 porri in duplicato.
Utilizzare un lettore di micropiacplate a fluorescenza per misurare l'intensità della fluorescenza gialla lucifera e calcolare la permeabilità apparente, come descritto nel testo del manoscritto. L'effetto del tempo di coltivazione sulla permeabilità di Lucifero Giallo è stato usato per determinare l'apparente cinetica della formazione di giunzioni strette. I valori apparenti di permeabilità sono diminuiti significativamente il settimo giorno rispetto al primo giorno, suggerendo che la barriera è diventata più stretta.
I valori apparenti di permeabilità si stabilizzarono fino al giorno 10. Ciò implicava che la formazione della barriera era completa e funzionale, con conseguente diminuzione del trasporto paracellulare giallo lucifero. L'assorbimento occidentale è stato usato per rilevare cambiamenti nell'espressione della proteina di giunzione stretta ZO-1 nel tempo.
Le due bande rappresentano le due isoforme ZO-1. L'analisi densitometrica ha rivelato che il valore in pixel di ZO-1 è aumentato dai giorni tre a sette dopo la semina, suggerendo che la proteina di giunzione stretta ZO-1 si è formata continuamente dai giorni tre ai sette. Dopo il trattamento di esaurimento del calcio il settimo giorno dopo la semina, la banda di ZO-1 era quasi non rilevabile, indicando che ZO-1 non era in grado di formarsi in assenza di ioni di calcio.
Come mostrato nei risultati, l'assorbimento occidentale della proteina ZO-1 può essere eseguito per determinare i cambiamenti nel livello di espressione delle proteine di giunzione strette, completando i dati di attività funzionale basati su Lucifer Yellow. Abbiamo anche scoperto che l'attività funzionale delle giunzioni strette nelle cellule endoteliali cerebrali umane non era influenzata dalla trasfezione della nanoparticella del DNA.
