Este protocolo é uma técnica robusta para determinar a integridade funcional das junções intercelulares em um modelo celular da barreira hematoencefálica humana. Este é um protocolo simples e bastante barato que permite calcular a permeabilidade aparente em um período de tempo mais curto em vez de executar um ensaio cinético mais longo. Este método também pode ser usado para determinar a integridade funcional de junções apertadas em células endoteliais cerebrais transfectadas com nanopartículas de DNA de polímeros.
Para começar o revestimento celular, coloque as pastilhas da cultura tecidual com membranas microporosas em uma placa de cultura de 24 poços. Adicione 400 microliters de 0,15 miligramas por mililitro tipo um em cada inserção de cultura tecidual. Em seguida, incubar por uma hora em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono.
Balance a placa de 24 poços suavemente para permitir a propagação da solução de colágeno sobre a membrana microporosa nas pastilhas da cultura tecidual. Após uma hora, remova a solução de colágeno e lave suavemente a membrana microporosa com 0,4 mililitros de tampão PBS 1X. Agora, as células de placa hCMEC/D3 com uma densidade de 50.000 células por centímetro quadrado nas pastilhas celulares.
Coloque a placa de 24 poços com a configuração da cultura tecidual na incubadora para permitir a fixação e proliferação celular. Incubar a placa por sete dias para permitir que as células atinjam 100% de confluência. Remova o meio de crescimento a cada dois dias e transfira 0,5 mililitros de mídia fresca pré-aquecida para as pastilhas de cultura tecidual.
Repita o procedimento de chapeamento para a mancha ocidental para determinar alterações na expressão ZO-1 para transfecção de nanopartículas de DNA, e para o ensaio ATP determinar a viabilidade celular em células transfeccionadas. Para determinar a permeabilidade aparente lúcifer amarela, em cada dia pós-semeadura, remova o meio de crescimento e adicione 1,5 mililitros de tampão de transporte pré-aquecido ao lado basolateral do poço. Agora adicione 58,3 microliters de 20 micromolar solução Amarela Lúcifer ao lado apical de cada inserção trans-bem.
Salve 50 microliters da solução para medições de fluorescência. Depois de remover completamente o tampão de PBS residual do lado apical, adicione a solução Lucifer Yellow o mais rápido possível para evitar a secagem das células. Certifique-se de volumes precisos da solução Lucifer Yellow no lado apical.
Certifique-se de adicionar o mesmo volume preciso da solução Lucifer Yellow em todas as pastilhas. Trabalhe rapidamente para evitar secar as células. Incubar as células em um agitador de placa rotativa a 100 RPM e 37 graus Celsius por 60 minutos.
Em seguida, remova 30 microliters da amostra lucifer amarela de cada compartimento apical. Transfira a solução Lucifer Yellow de 20 micromolares e as amostras laterais apical para tubos pré-rotulados. Agora diluir a amostra dez vezes usando o buffer de transporte.
Remova 500 microliters de cada compartimento basolateral e transfira a amostra para tubos pré-rotulados. Prepare uma série de padrões Lúcifer Amarelo para a curva padrão. Adicione 100 microliters de cada amostra apical e basolateral padrão a cada poço de uma placa preta de 96 poços em duplicata.
Use um leitor de microplaca de fluorescência para medir a intensidade da fluorescência amarela de Lúcifer e calcular a permeabilidade aparente, conforme descrito no texto manuscrito. O efeito do tempo de cultivo na permeabilidade lúcifer amarela foi usado para determinar a cinética aparente da formação de junção apertada. Os valores aparentes de permeabilidade diminuíram significativamente no sétimo dia em comparação com o primeiro dia, sugerindo que a barreira ficou mais apertada.
Os valores aparentes de permeabilidade estabilizaram-se até o dia 10. Isso implicava que a formação da barreira estava completa e funcional, resultando na diminuição do transporte paracelular Amarelo Lúcifer. A mancha ocidental foi usada para detectar alterações na expressão da proteína de junção apertada ZO-1 ao longo do tempo.
As duas bandas representam os dois isoforms zo-1. A análise da densitometria revelou que o valor do pixel do ZO-1 aumentou dos dias três para sete pós-semeadura, sugerindo que a proteína de junção apertada ZO-1 se formou continuamente dos dias três a sete. Após o tratamento de esgotamento do cálcio no sétimo dia pós-semeadura, a banda de ZO-1 era quase indetectável, indicando que o ZO-1 era incapaz de se formar na ausência de íons de cálcio.
Como mostrado nos resultados, a mancha ocidental da proteína ZO-1 pode ser realizada para determinar mudanças no nível de expressão de proteínas de junção apertadas, complementando os dados de atividade funcional à base de Lúcifer Amarelo. Também descobrimos que a atividade funcional de junções apertadas em células endoteliais cerebrais humanas não foi afetada pela transfecção de nanopartículas de DNA.
