Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia sulla dinamica della colonizzazione e dell'infezione da microrganismi nel tratto gastrointestinale. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è più rappresentativo delle infezioni di origine alimentare nell'uomo e che riduce il potenziale danno tissutale nei pesci rispetto al gavage orale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di lavaggio possono essere difficili da eseguire a causa della natura altamente mobile della paramecia.
Da una coltura in crescita viva, aggiungere un millilitro di coltura di paramecium e un millilitro di una coltura e-coli MG1655 a un pallone da coltura tissutale da dieci millilitri contenente otto millilitri di mezzo E3. Ruotare leggermente il pallone prima di posizionarlo a 22 gradi Celsius passando un millilitro della cocoltura in un nuovo pallone da coltura tissutale da dieci millilitri contenente nove millilitri di mezzo E3 fresco, integrato con 108 unità di formazione di colonie per millilitro di e-coli MG1655, ogni due settimane. Per determinare l'emiludi batterica all'interno di un paramecium contare il numero di parameci da una densità ottica di 600 batteri paramecia co-coltura e aggiungere un'aliquota di 50 microlitri di supernatante a un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri ogni ora per sei ore.
Aggiungere ai tubi 950 microlitri di un tensioattivi non ionico dell'uno per cento in PBS. E liscigere la paramecia in ogni campione con un minuto di vortice, quindi fare una diluizione su dieci di ogni campione in PBS sterile. E piastra 100 microlitri di ogni diluizione su piastre selettive per un'incubazione di 16 ore a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo, conta solo le singole colonie isolate e distinte per determinare il numero di colonie batteriche sul piatto. E identificare una piastra con una diluizione che produce 30-300 unità che formano colonie. Il giorno prima dell'infezione, raccogliere un volume di batteri da una densità ottica di 600 coltura per trattamento mediante centrifugazione.
E sospendere di nuovo i pellet in un millilitro di mezzo E3 per tubo. Successivamente, aggiungere un microlitro di una macchia batterica appropriata a ogni sospensione batterica. E proteggere i tubi foto sbiancamento con lamina.
Prima di incubare i campioni di batteri con rotazione end-over-end per 15 minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare i batteri due volte in un grande volume di mezzo E3 per rimuovere il colorante in eccesso. E sospendere di nuovo i pellet in un millilitro di mezzo E3 fresco per tubo.
Quindi, aggiungere un millilitro di sospensione batterica a ciascuno dei due contenitori di paramecia fresca per condizione per un'incubazione di due ore a temperatura ambiente. Estrarre il contenuto di entrambi i contenitori per condizione in singoli tubi conici da 50 millilitri. E pellettò i campioni per centrifugazione.
Utilizzando una pipetta sterilogica, sostituire circa dieci millilitri del supernatante E3 in ogni tubo con dieci millilitri di mezzo E3 fresco per 3 lavaggi per centrifugazione. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere circa dieci millilitri dei supernatanti E3, facendo attenzione a non interrompere i pellet e sospendere di nuovo i pellet nei restanti dieci millilitri di mezzo E3. Trasferire 500 microlitri di ciascuna sospensione in singoli tubi microcenrifugo da 1,5 millilitri e pelletare la paramecia mediante centrifugazione.
Scartare 400 microlitri dei supernatanti e aggiungere 20 microlitri di soluzione di formaldeide al 36,5% ai restanti 100 microlitri di paramecia con pipettazione delicata. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, misurare il volume totale effettivo in ogni tubo per pipetta prima di contare il numero di paramecia morta per millilitro. Per l'infezione alimentare del pesce zebra, diluire i campioni di paramecia a due volte dieci fino alla cinque paramecia per millilitro di concentrazione media E3.
E aggiungere 3 millilitri di ogni coltura di paramecia a un pozzo di un piatto di 6 po 'per condizione. Successivamente, trasferire dieci zebrafish anestetizzati in ogni pozzo in un volume minimo di liquido. E incubare le co-colture per due ore a 30 gradi Celsius in un'incubatrice diurna in condizioni di luce del giorno.
Per determinare la velocità di preda, guarda il pesce zebra che alimenta sotto un microscopio stereo mentre acquisisci filmati video dell'acquisizione della preda. La cattura delle prede è caratterizzata dal colpo di un pesce zebra verso la preda. Ogni attacco è stimato come un evento di acquisizione delle prede.
Al termine dell'incubazione, lavare il pesce zebra in 5 diversi pozzi contenenti 3 millilitri di mezzo E3 fresco integrato con 100 milligrammi per litro di tricaina per pozzo. E incorporare ogni zebrafish in 3 millilitri dell'1% di agarosio a bassa fusione in una piastra nera ben datata a sei pozzi. Quando tutti i pesci sono stati incorporati, posizionare la piastra sotto un microscopio stereo e utilizzare una punta di caricamento in gel ritagliato per assicurarsi che le teste siano a sinistra e che le code siano a destra in ogni campo di visualizzazione.
Attendere 5 minuti per impostare l'agarosio, quindi sovrapporre il pesce incorporato con mezzo E3 fresco integrato con tricaina e osservare il pesce zebra su un microscopio fluorescente per valutare l'avanzamento delle infezioni batteriche. Per l'e-coli patogeno, la densità batterica iniziale è di 790 batteri per paramecium, e i batteri vengono degradati all'interno dei vacuoli di ogni atomo tagliato al paramecium con un'emivizione di circa 2,3 ore. La preda è accompagnata da un comportamento caratteristico e sorprendente, e la determinazione del tasso di preda si basa sull'ipotesi che ogni colpo porti all'internalizzazione di 1 paramecium.
Dopo la digestione, i batteri liberi si spostano dal prenega all'intestino medio e posteriore, dove vengono rilevati circa 1-2 ore dopo l'inizio della preda. S-enterica, ad esempio, si localizza principalmente nelle mucose intestinali con qualche invasione epiteliale che porta all'infiltrazione di neutrofili nell'epitelio. Non dimenticare che lavorare con determinati tipi di batteri può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare i dispositivi di protezione individuale adeguati dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
