Questo metodo di convalida e valutazione dell'accuratezza dell'iniezione fornisce un'importante fase di controllo della qualità e una fase cruciale negli studi sugli animali per facilitare iniezioni di vene della coda coerenti e riproducibili. Valutare l'iniezione tramite imaging a fluorescenza immediatamente dopo l'eseguito offre il vantaggio di determinare se il tuo agente è entrato nella circolazione sanguigna nella quantità prevista. L'iniezione di vene di coda è una manipolazione pratica che beneficia della dimostrazione visiva e che può essere migliorata osservando la clearance dell'agente iniettato dal sito di iniezione.
A dimostrare la procedura con Muzamil Saleem sarà Brooke Deal, dottoranda del mio laboratorio. Prima dell'iniezione della vena di coda, posizionare un animale anestetizzato lateralmente in un imager a fluorescenza nel vicino infrarosso con il sito di iniezione sulla coda esposta per stabilire una linea di base a fluorescenza. Dopo che l'immagine è stata acquisita, trasferire l'animale sulla panchina chirurgica in posizione prona e dilatare la vascucolatura della coda immergendola in acqua tiepida.
Dopo circa un minuto, orienta la coda in modo che il lato laterale sia in vista. La vena laterale della coda dovrebbe apparire di colore scuro. Sterilizzare la lunghezza della vena con tamponi di alcol.
Posizionare la coda lateralmente e inserire un lato smussato dell'ago da 25 a 27 gauge e parallelo alla coda sollevata nella vena laterale di coda selezionata a partire dalla regione delle vertebre coccigee distali della coda e spostandosi più prossimale se il corretto posizionamento dell'ago fallisce se necessario. In un inserimento di successo dell'ago, il flashback del sangue dovrebbe essere osservato nel bordo dell'ago. Se non è evidente alcun flashback, spostare lentamente la punta dell'ago senza rimuoverla dalla coda per trovare l'inserimento delle vene.
Quando l'ago è stato posizionato correttamente, inserire una siringa con il materiale iniettabile nel bordo dell'ago e deprimere lo stantuffo per consegnare il contenuto nella vena. In alternativa, è possibile utilizzare un catetere con un indicatore del flusso sanguigno. Un flashback rapido nel segmento indicatore del catetere verrà osservato dopo il corretto posizionamento.
Una leggera contro pressione può quindi essere utilizzata per estrarre sangue nella siringa per confermare il corretto posizionamento nel vaso prima dell'iniezione. Ancora una volta, non si sentirà alcuna resistenza. Una volta che tutto il materiale è stato consegnato, rimuovere l'ago e applicare la pressione con una garza sterile per almeno un minuto per garantire la coagulazione.
Contrassegnare il sito di iniezione con una penna per assicurarsi che il sito di iniezione sia visibile sul canale di luce bianca dell'immagine acquisita. Per valutare il segnale di fluorescenza post-iniezione nel sito di iniezione, riportare l'animale allo stadio di imaging vicino all'infrarosso e orientare l'animale sul suo lato laterale per esporre il sito di iniezione sulla coda laterale per l'imaging come dimostrato. Per analizzare la fluorescenza del sito di iniezione basale e post-iniezione, le regioni di interesse possono essere disegnate nel software di imager vicino all'infrarosso sulla coda vicino al sito di iniezione prima e intorno all'area di fluorescenza dopo l'iniezione della vena della coda.
Le iniezioni fornite con successo dimostreranno livelli quasi altrettanto bassi di segnale fluorescente prima e dopo l'iniezione. Le immagini in cui la fluorescenza è visibile per tutta la lunghezza della coda non sono accettabili e devono essere rimosse dall'analisi. Qualsiasi tecnica molecolare comportamentale, chirurgica o ex vivo può essere eseguita normalmente seguendo questa procedura.
Questa tecnica fornisce il controllo di qualità per un'iniezione di vena di coda, rivelando la rapida clearance da parte del flusso sanguigno venoso dell'agente correttamente iniettato o la messa in comune nel sito di iniezione se la vena viene persa. Il reagente utilizzato in questo metodo non è pericoloso, tuttavia, devono essere prese le precauzioni appropriate se l'agente a base di fluorescenza è incorporato con un materiale pericoloso.
