Questo protocollo dimostra una nuova procedura per l'immunofluorescenza sequenziale e l'immunoistochimica sulle criosezioni delle embroy zebrafish in fase iniziale, che consente precise analisi di co-localizzazione in specifiche popolazioni cellulari. Il vantaggio principale di questo protocollo è la sua flessibilità. Combina immunofluorescenza e tecniche immunoistochimiche utilizzando un'unica criosezione per massimizzare la morfologia dei tessuti, la co-localizzazione dell'espressione e la compatibilità degli anticorpi.
Questo protocollo potrebbe essere applicato ad altri pesci o modelli anfibi in quanto questi ricercatori spesso affrontano complicazioni simili con la disponibilità di anticorpi e spesso eseguono tipi simili di esperimenti. Lavorare con le criosezioni embrionale in fase iniziale può essere complicato poiché sono piccole e la criosezione può essere impegnativa, ma la preparazione e la pratica avanzate aiuteranno ad alleviare eventuali lotte in questo metodo. Ci sono più passaggi nel nostro protocollo che richiedono particolare gestione e cura e possono essere difficili da padroneggiare senza vedere qualcuno dimostrare le tecniche.
Per iniziare, trasferire precedenti embrioni di zebrafish chimerici post-fecondazione fissi e preparati dopo la fecondazione da un tubo con miscela 15 25 OCT a uno stampo di plastica utilizzando forcep riducendo al minimo qualsiasi trasferimento della miscela. Riempire lo stampo circa la metà con mezzo OCT e mescolare delicatamente gli embrioni in esso. Preparare stampi di plastica etichettati e trasferire gli embrioni desiderati negli stampi di plastica etichettati vuoti, riducendo al minimo il riporto del mezzo OCT.
Quindi riempire delicatamente con oct medio fino alla parte superiore degli stampi con embrioni. Lavorando al microscopio stereo leggero per la visualizzazione, utilizzare aghi per disporre gli embrioni nell'orientamento desiderato. Quindi posizionare gli stampi preparati in un contenitore isolato con una piattaforma metallica e congelarli sul ghiaccio secco.
Posizionare delicatamente un secchio di ghiaccio sulla piattaforma metallica per creare una camera fredda e congelare per circa 30 minuti. Utilizzando un criostato impostato a meno 20 gradi Celsius, tagliare gli embrioni incorporati in criosezioni spesse da 10 a 12 micrometri mentre si controlla periodicamente la profondità della sezione su un microscopio per monitorare la posizione e il tessuto. Posizionare le sezioni sugli scivoli di vetro carichi e asciugarli all'aria a temperatura ambiente durante la notte.
Lavare le diapositive tre volte per cinque minuti in 1X PBS in un contenitore appropriato. Posare gli scivoli su una superficie piana in una camera umida. Utilizzare una penna barriera per delineare le sezioni per mantenere liquido sulle diapositive.
Pipettare 200 microlitri di tampone di blocco per sezione e incubare in tampone di blocco per due ore a temperatura ambiente. Preparare la diluizione dell'anticorpo primario e bloccare il tampone e mescolare bene mediante pipettazione. Puntare delicatamente le diapositive per drenare il tampone del blocco e tornare alla camera umida.
Pipetta 200 microlitri di soluzione anticorpale primaria per sezione sui vetrini e 200 microlitri di tampone di blocco sulle sezioni appropriate come controllo. Incubare gli scivoli a quattro gradi Celsius durante la notte in una camera umida piena di acqua deionizzata assicurandosi di sigillare i bordi della camera per aiutare a trattenere l'umidità. Lavare le diapositive tre volte per cinque minuti in 1X PBS e in un contenitore appropriato.
Preparare la diluizione dell'anticorpo secondario durante il lavaggio e bloccare il tampone e mescolare bene con la pipettazione. Dopo aver posato i vetrini su una superficie piana in una camera umida, aggiungere 200 microlitri di soluzione anticorpale secondaria per sezione. Incubare le diapositive in soluzione anticorpale secondaria a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.
Lavare le diapositive tre volte per cinque minuti in 1X PBS in un contenitore appropriato. Dopo aver posizionato i vetrini su una superficie piana, aggiungere la soluzione di colorazione nucleare su ogni sezione e incubare coperta per 10 minuti. Dopo aver prosciugato la soluzione di colorazione nucleare, montare i vetrini con mezzi di montaggio fluorescenti non indurenti e uno scivolo di copertura in vetro.
Assicurarsi di tenerli al buio a quattro gradi Celsius fino all'imaging. Posizionare le diapositive in singoli contenitori con 1X PBS e conservare piatto a quattro gradi Celsius durante la notte, mentre delicatamente agitato per allentare il coperchio scivola abbastanza in modo che si staccano quando agitato. Assicurarsi di non premere sul coperchio o tentare di rimuovere manualmente lo slittamento del coperchio, ma attendere che si staccano con un movimento forzato minimo.
Dopo aver rimosso i coperchi, trasferire delicatamente le diapositive in un contenitore con PBS fresco 1X. Rimuovere il PBS 1X e incubare le diapositive in salina tris-buffered 1X con lo 0,1% di un tensioattiva non ionico tre volte per cinque minuti a temperatura ambiente. Incubare i vetrini in soluzione di perossido di idrogeno al 3% a temperatura ambiente per 15 minuti.
Quindi posare la diapositiva piatta e aggiungere la goccia del buffer di blocco in modo saggio sulla superficie. Ingoiare delicatamente le diapositive per drenare il buffer di blocco. Asciugare l'area intorno alle sezioni e posizionare gli scivoli piatti in una camera umida.
Aggiungere 200 microlitri di soluzione di anticorpi primari per sezione sui vetrini e incubare in camera umida a quattro gradi Celsius durante la notte. Ingoiare delicatamente le diapositive per drenare la soluzione anticorpale primaria e lavare due volte per cinque minuti in 1X TBST. Quindi applicare pronto all'uso lo sfondo riducendo la caduta del reagente di blocco in modo saggio su ogni sezione e incubare in camera umida a temperatura ambiente per 20 minuti.
Ingoiare delicatamente le diapositive per drenare il buffer di blocco. Asciugare con cura l'area intorno alle sezioni e posizionare gli scivoli piatti in una camera umida. Applicare una soluzione anticorpale secondaria pronta all'uso su ogni sezione in modo saggio e incubare in camera umida a temperatura ambiente per 30 minuti.
Puntare delicatamente le diapositive per drenare la soluzione anticorpale secondaria e lavare due volte per cinque minuti in 1X TBST. Dopo aver asciugato l'area intorno alle sezioni, posizionare i vetrini su una superficie piana e aggiungere 200 microlitri del substrato cromogenico HRP ad ogni sezione. Avviare un timer quando il substrato è stato applicato al primo scivolo e incubare a temperatura ambiente per tre minuti.
Scolare la soluzione del substrato. Risciacquare brevemente i vetrini in un apposito contenitore con 1X PBS e lavarli in acqua deionizzata due volte per cinque minuti con delicata agitazione. Controsostenere le diapositive posizionandole in soluzione di colorazione ematossilina per un massimo di 30 secondi e lavarle tre volte per cinque minuti ciascuna in acqua deionizzata.
Incubare gli scivoli in un contenitore contenente tapwater di Scott per un minuto e quindi lavare di nuovo tre volte per cinque minuti in acqua deionizzata. Disidratare gli scivoli attraverso una serie di tipi di etanolo diluiti in acqua deionizzata e xilene in una cappa chimica. Dopo aver rimosso i vetrini dallo xilene, aggiungere immediatamente il supporto di montaggio a base di toluene e posizionare uno slittamento del coperchio.
Per garantire il successo durante lo scivolamento del coperchio, è importante lavorare da un lato all'altro dello scivolo abbassando lentamente lo slittamento del coperchio per evitare bolle che oscurano il tessuto. Infine, visualizzare e visualizzare le diapositive utilizzando un microscopio a luce composta e una fotocamera digitale con ingrandimento 100X. Anticorpi specifici utilizzati qui per rilevare contemporaneamente cellule proliferatorie e cellule donatrici identificate e quantificate che proliferano attivamente.
Dopo l'immunofluorescenza e l'immunoistochimica è essenziale generare immagini di alta qualità al fine di identificare con precisione le singole cellule. Un programma di analisi delle immagini è stato utilizzato per eseguire la sovrapposizione dell'immagine. Quando si tenta questa procedura è più importante macchiare e contrastare adeguatamente le diapositive di macchie durante l'immunoistochimica.
Dopo questa procedura è possibile eseguire metodi aggiuntivi come modifiche al protocollo originale, ad esempio utilizzando diverse combinazioni di anticorpi, tipi di tessuto o specie. Le immagini possono anche essere analizzate in vari modi per ottenere dati pertinenti. Questa tecnica ci ha permesso di guardare alla co-localizzazione e a più background genetici come un modo per indagare le interazioni da cellula a cellula e potrebbe essere applicata in modo simile ad altre tecniche che richiedono un'analisi dettagliata della co-localizzazione.
Molti dei reagenti dell'immunoistochimica sono pericolosi e devono essere trattati di conseguenza. Lavorare con etanolo, xilene e rigido di montaggio deve essere eseguito nella cappa. I rifiuti DAB devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi e i lavaggi post DAB devono essere sbiancati.
