L'immunoistochimica a montaggio intero è una tecnica relativamente rapida e semplice che consente l'osservazione spaziale e temporale delle proteine direttamente in un tessuto o organismo utilizzando anticorpi etichettati. L'utilità di questa tecnica è che consente la colorazione di un tessuto intatto o di un organismo senza doverlo prima sezionamento e la microscopia confocale può essere utilizzata per generare una rappresentazione tridimensionale del modello di espressione proteica. L'immunoistochimica è ampiamente utilizzata nella ricerca biomedica per comprendere l'eziologia e i meccanismi molecolari che sono alla base della malattia.
È anche un prezioso strumento diagnostico per identificare i tumori nei campioni patologici. Per iniziare, preparare i serbatoi di deposizione delle uova riempiti con acqua di sistema e con una rete o una fodera fessurata in posizione. Posizionare coppie di sesso misto zebrafish adulti in gruppi nei serbatoi durante la notte.
Usa un ciclo chiaro/scuro di 14 ore e 10 ore con luci che si accese alle 9 del .m. La mattina seguente, con le luci accese, cambiare l'acqua del serbatoio di deposizione delle uova con acqua fresca del sistema per rimuovere le feci. Una volta deposte le uova, riportare gli adulti ai serbatoi di casa.
Raccogliere le uova disegnandole utilizzando una pipetta di trasferimento. Trasferire 50 uova in ogni piastra di Petri riempita a metà strada con mezzo embrionale. Rimuovere eventuali uova opache e torbate che sono morte o non sono riuscite a dividersi.
Incubare il piatto di uova a 28,5 gradi Celsius fino a 23 ore dopo la fecondazione. Se gli embrioni sono più vecchi di 24 ore dopo la fecondazione, con una pipetta trasferire gli embrioni a 200 PTU micromolare nel mezzo embrionale per prevenire la melanogenesi. Al microscopio stereo, dechorionare gli embrioni non odiati usando forcep a punta ultra fine.
Utilizzando pipette Pasteur lucidate dal fuoco per ridurre al minimo i danni, trasferirle in piastre petri in vetro o plastica rivestite con 1-2% di agarosio sciolto in mezzo embrionale. Quindi trasferire gli embrioni in tubi di centrifuga da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta in plastica o lucidata a fuoco. Rimuovere il mezzo embrionale con una micropipetta.
Lasciare solo abbastanza liquido per coprire solo gli embrioni. Fissare gli embrioni in PFA al 4% per una o due ore con un dolce dondolo a temperatura ambiente. Quindi, lavare gli embrioni tre volte in 1X PBS e 1%PBTriton per cinque minuti.
Utilizzare immediatamente gli embrioni o conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Per la conservazione a lungo termine, disidratare e conservare gli embrioni in metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius. Per reidratare gli embrioni, eseguire incubazioni seriali cinque minuti ciascuna a temperatura ambiente con quantità decrescenti di metanolo e PBS e PBTriton per il lavaggio finale.
Procedere con la preparazione dell'embrione secondo il manoscritto. Selezionare una soluzione di blocco corrispondente alla specie ospite dell'anticorpo secondario, ad esempio siero di capra al 10% in PBTriton con o senza due milligrammi per millilitro di BSA. Aggiungere 0,5 millilitri della soluzione di blocco nel tubo contenente l'embrione e posizionare il tubo su un rocker per una o tre ore a temperatura ambiente.
Quindi incubare l'embrione in anticorpi primari diluiti in soluzione di blocco e PBTriton durante la notte a quattro gradi Celsius durante il dondolo. Al mattino, lavare l'embrione cinque volte in PBTriton per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente durante il dondolo. Quindi selezionare un anticorpo secondario in base alla specie ospite dell'anticorpo primario e alla lunghezza d'onda desiderata a 488 nanometri.
Aggiungere l'anticorpo secondario diluito nella soluzione di blocco nel tubo contenente l'embrione. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e incubare per due ore a temperatura ambiente durante il dondolo. Successivamente, lavare gli embrioni tre volte in PBTriton per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente mentre sono coperti con foglio di alluminio e dondolo.
Con una pipetta, trasferire gli embrioni in una soluzione di glicerolo al 50% in PBS su un letto di 2%agarosio in mezzo embrionale. Per rimuovere il tuorlo, trasferire 200 microlitri di 1X PBS in uno scivolo di depressione o in un semplice scivolo di vetro. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per spostare uno o più embrioni nella goccioline PBS.
Utilizzare pin ultra fini e perni di insetti doppi zero per rompere il tuorlo e raschiare molto delicatamente i granuli di tuorlo dalla superficie ventrale dell'embrione. Rimuovere i granuli di tuorlo e reintegrare con PBS in base alle esigenze. Dopo il montaggio, posizionare il campione sullo stadio del microscopio.
Individuare l'area di interesse selezionando un esempio relativamente luminoso. Regolare l'esposizione e il guadagno della telecamera in modo che il segnale sia sufficientemente luminoso senza saturarsi. Quando si confrontano tra gli embrioni sperimentali etichettati con anticorpi e gli embrioni anticorpali di controllo, utilizzare le stesse impostazioni di esposizione.
Questo protocollo di immunoistochimica a montaggio intero è uno strumento prezioso per lo studio dell'espressione spaziale e temporale delle proteine utilizzando lo sviluppo del pesce zebra. La subunità GluN1 del recettore del glutammato di tipo NMDA ha rivelato l'espressione delle subunità del recettore del glutammato durante lo sviluppo dei muscoli zebrafish a 23 ore dopo la fecondazione. Sezioni congelate di embrioni post fecondazione di 72 ore sono state montate su scivoli e immunostained per fosfo-H3, un marcatore di cellule proliferato.
Diverse cellule espresse fosfo-H3 e l'espressione era più notevole nelle zone ventricolari. L'anticorpo di controllo IgG del topo e l'esclusione degli anticorpi primari hanno rivelato un basso livello di espressione non specifica. È importante selezionare soluzioni di blocco appropriate e anticorpi secondari in base alle specie ospiti degli anticorpi primari per garantire il rilevamento e ridurre al minimo la colorazione non specifica.
L'immunoistochimica deve essere verificata per garantire che il segnale osservato sia effettivamente la proteina di interesse. Gli esperimenti di follow-up di solito comportano l'uso di organismi geneticamente o modificati per l'ambiente. L'immunoistochimica garantisce ai ricercatori la possibilità di osservare le proteine in situ, accelerando notevolmente la nostra comprensione di numerosi sistemi sia nella biologia di base che applicata, in particolare durante lo sviluppo degli embrioni.
Il metanolo e la formaldeide sono tossici e devono essere maneggiati con attenzione. I rifiuti devono essere raccolti e smaltiti secondo procedure istituzionali.
