Ringraziamo Susan Farmer e il personale della struttura di ricerca zebrafish UAB per la cura zebrafish. Finanziamenti erogati dai fondi di start-up del Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia.

NOTA: Questo protocollo è stato approvato dalla University of Alabama a Birmingham Institutional Animal Care ed uso comitato. 1. Allevamento Zebrafish e collezioni Egg <ol><li> Tre giorni prima di iniziare esposizioni chimiche, montare vasche di allevamento con divisori per maschi e femmine separati. Riempire ogni metà serbatoio con acqua sistema di acquacoltura. Utilizzando una rete, trasferire Tg (5xERE: GFP) i pesci c262/c262 a vasche di allevamento, mettendo 2 maschi e 3 femmine in ciascun serbatoio separato da un divisorio. Mettere un coperchio su ogni serbatoio e l&#39;etichetta con la data e le tensioni da attraversare. </li><li> La mattina seguente, rimuovere tutte le barriere e inclinazione deflettori per creare una zona poco profonda ad una estremità della vasca di allevamento. Lasciare zebrafish per accoppiarsi, la raccolta di embrioni a intervalli di 10 min per assicurare precisione messa in scena dello sviluppo. Uova Clean di risciacquo attraverso un colino da tè con E3B medio e embrioni filo delicatamente in piastre di Petri. Ritorno pesci adulti di permanenteserbatoi. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, ordinare, contare, e rimuovere gli embrioni non fecondate, anomali o danneggiati. Luogo embrioni in piastre di Petri in E3B medio e casa a 28,5 ° C con 14:10 di luce: ciclo scuro. Densità embrione può influenzare lo sviluppo. Mettere non più di 100 embrioni in un piatto mm 100 x 35 e non più di 50 embrioni in un piatto mm 60 x 15. </li><li> Entro il 24 hpf, sostituire il supporto con E3B contenente 200 mM 1-fenil 2-tiourea (PTU). PTU previene la formazione di pigmenti e mantiene embrioni di zebrafish e larve trasparenti per una migliore chiarezza di immagine. ATTENZIONE: concentrato PTU magazzino è pericoloso; indossare i guanti quando si effettua soluzione E3B + PTU. </li><li> Al 1 ° giorno dopo la fecondazione (dpf), rimuovere manualmente il corion da ogni embrione utilizzando una pinza sottile. Il corion non sembra influenzare la penetrazione degli estrogeni, tuttavia rimozione migliora la nitidezza delle immagini. Non vi è alcuna necessità di rimuovere chorions dal supporto. NOTA: In alternativa alla dechorionation manuale, lotti di embrioni possono essere Chémically dechorionated usando 1 mg / ml pronasi trattamento, come descritto in precedenza 11. </li></ol> 2. Trattamento chimico di embrioni <ol><li> Il giorno prima del trattamento, preparare soluzioni madre di ogni prodotto chimico in concentrazione di 1.000 volte in DMSO (o solvente appropriato). Ad esempio, per esporre embrioni per 10 pM bisfenolo A (BPA), preparare una soluzione madre BPA 10 mM in 100% DMSO. Questo assicura concentrazione DMSO uniforme in ogni trattamento e permette una 1:1000 diluizione non tossico di DMSO per servire come un controllo del veicolo. Le soluzioni Negozio di archivi a -20 ° C. Per questo protocollo, embrioni saranno esposti a 1 mM e 10 mM BPA, 18,5 nM e 1,85 pM genisteina, 367 nM di estradiolo (controllo positivo) e il veicolo (0,1% DMSO, controllo negativo). ATTENZIONE: Sostanze chimiche come il BPA e estradiolo sono pericolosi e possono avere effetti deleteri sul feto umano. Maneggiare interferenti endocrini con cura e usare sempre un equipaggiamento di protezione personale.</li><li> Il giorno del trattamento, disgelo preparato archivi soluzioni chimiche. Diluire 1:1.000 pipettando 1 ml E3B + PTU in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e l&#39;aggiunta di 1 ml di soluzione madre chimica. Vortex vigorosamente. Diluire DMSO 1:1000 in E3B + PTU come un controllo del veicolo. Utilizzare 1 mL E3B + PTU in una provetta da 1,5 ml come un controllo non trattato. </li><li> Usando una grande pipetta di plastica foro, trasferimento di embrioni da piastre di Petri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, 3 embrioni per pozzetto, 3 pozzi per ogni condizione. Per evitare l&#39;evaporazione durante il trattamento prolungato, omettere embrioni da righe e colonne esterne della piastra (righe A ed E, colonne 1 e 12). Pozzi esterni possono essere riempiti con 300 ml di E3B + PTU. Etichettare il coperchio piatto in modo appropriato. </li><li> Rimuovere i supporti da ogni pozzetto con una multa a punta pipetta di trasferimento di plastica. Lavorare velocemente per evitare di seccare gli embrioni. </li><li> Aggiungere 200 ml di soluzione di trattamento in corrispondenti bene. Mettere il coperchio underneath la piastra come guida per garantire aggiunta di trattamenti nei pozzetti appropriati. Vortex ogni provetta prima di pipettare di distribuire il prodotto chimico in soluzione. Visivamente confermare ogni embrione è nella soluzione di trattamento. Se gli embrioni sono sul lato del pozzo, utilizzare una pipetta pulita per lavarli nel pozzetto con la soluzione di trattamento. </li><li> Porre la piastra in incubatore a 28,5 ° C. Gli embrioni saranno analizzate per fluorescenza a 72 HPF. </li></ol> 3. Automated Imaging di embrioni in piastre con 96 pozzetti <ol><li> Anestetizzare embrioni aggiungendo 10 ml di 4 mg / ml tricaine a ciascun pozzetto. NOTA: Anestetizzare gli embrioni prima di imaging. A 24-96 hpf, zebrafish esporre movimento spontaneo e una risposta ad uno stimolo alla fonte di luce che cambia durante l&#39;acquisizione delle immagini. Anestetizzante embrioni riduce il movimento durante l&#39;imaging. </li><li> Posizionare la piastra a 96 pozzetti in fase motorizzato e calibrare lo stadio. Utilizzando Zeiss Zen Blu software 2011 per la microscopia automaticamentesu e controllo, selezionare l&#39;opzione porta-campioni e selezionare multiwell 96. Selezionare Calibra. Seguire le istruzioni graduali per calibrare il palco. NOTA: Non deselezionare il pulsante di piastrelle dopo questo passaggio. Se il pulsante piastrelle è deselezionata, le impostazioni di calibrazione possono essere persi e la piastra a 96 pozzetti dovranno essere ricalibrato. </li><li> Utilizzando un obiettivo 10x e il campo chiaro (BF) impostazione, identificare un embrione controllo positivo e configurare le impostazioni di esposizione appropriato per BF e canali GFP, facendo in modo che il segnale di fluorescenza non è saturare la fotocamera. Concentrarsi su un unico embrione e programmare il microscopio per acquisire 3 totali Z-sezioni, una immagine 50 pm sopra e una 50 micron sotto il piano focale corrente. NOTA: Poiché i vari tessuti occupano diversi piani focali, questo farà sì che per ogni immagine zebrafish vengono catturate con il cuore e il fegato a fuoco. </li><li> Impostare i parametri del software per acquisire un&#39;immagine in maiolica con GFP e BF channels. Nella scheda di acquisizione, selezionare la configurazione avanzata. Selezionare le regioni piastrelle, poi le piastrelle. Scegli l&#39;opzione cerchio bene. NOTA: Piastrelle viene utilizzato per creare un&#39;immagine composita di ogni bene. Un campo di vista singolo cattura solo una piccola parte di ogni pozzetto. La funzione di segmentazione in grado di catturare automaticamente aerei adiacenti da ciascun pozzetto campi di vista, creando un&#39;immagine composita di tutto il bene. È quindi possibile catturare automaticamente 96 immagini composite per piastra, dove ogni immagine composita contiene diverse decine di immagini singole di un singolo pozzetto. </li><li> Selezionare vettore e fattore di riempimento del 90%. Selezione di un fattore di riempimento del 90% di catturare immagini multiple dei pozzetti scelti in modo che il 90% della superficie di ciascun pozzetto sarà visibile nell&#39;immagine composita. NOTA: Quando si seleziona fattore di riempimento, un diagramma verrà visualizzato rappresentante l&#39;area da acquisire. Selezionare una percentuale che includerà la zona del pozzoche è appropriato per l&#39;esperimento. </li><li> In Opzioni, selezionare la quantità di sovrapposizione desiderato. NOTA: Quando cucire insieme le piastrelle per una singola immagine rappresentativa, una sovrapposizione di 5-10% consente una cucitura uniforme tra le immagini. Tuttavia, se l&#39;immagine cuciture è inutile, con una sovrapposizione 0% ridurrà il tempo di imaging. Uso 90% fattore di riempimento e 5% di sovrapposizione, un&#39;immagine composita di un singolo pozzetto consiste di 59 immagini singole. </li><li> Inizia imaging. Il microscopio acquisirà automaticamente le immagini. </li><li> Ispezionare manualmente immagini composite di ogni pozzetto per fluorescenza tessuto-specifico (Figura 1). </li><li> NOTA: E &#39;meglio iniziare con il controllo positivo per confermare che l&#39;esposizione chimica ha lavorato prima di osservare i pozzi trattamento sperimentale. </li></ol> 4. Manuale Acquisizione Immagine di embrioni in piastra a 96 pozzetti NOTA: Per confermare i risultati, utilizzare un obiettivo 20x lunga distanza di lavoro a corrente alternataquaderno immagini più dettagliate manualmente (Figura 2). <ol><li> Utilizzando un obiettivo 20x e il campo chiaro (BF) impostazione, identificare un embrione controllo positivo e configurare le impostazioni di esposizione per i canali BF e GFP in modo appropriato, facendo in modo che il segnale di fluorescenza non è saturare la fotocamera. </li><li> Identificare le singole embrioni e catturare immagini manualmente. NOTA: Una volta che le impostazioni di esposizione sono state selezionate per l&#39;embrione controllo positivo, non modificare le impostazioni. Questo consente un confronto dell&#39;intensità di fluorescenza come ogni immagine viene catturata in condizioni uniformi. </li></ol>

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive un metodo semplice per automaticamente immagine di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish. Il protocollo è stato sviluppato utilizzando un Zeiss Axio Observer. Z1 con Zen software Blu 2011, ma la tecnica può essere adattata utilizzando qualsiasi microscopio invertito con un palco motorizzato e software di controllo del microscopio in grado di eseguire piastrelle per creare immagini composite. Dotare un microscopio invertito con una fase motorizzato può fornire una pratica a...

Zebrafish transgenici sono stati sviluppati che consentono la visualizzazione diretta di attività in vie di segnalazione, quali fattori di crescita dei fibroblasti 1, acido retinoico 2 e 3 estrogeni, in embrioni vivi. Tali strumenti consentono di screening per sostanze chimiche che perturbano vie di segnalazione (dosati come cambiamento di intensità di fluorescenza) o per le sostanze chimiche che modulano segnalazione in modo tessuto-specifico (cambiamento di localizzazione fluorescenza) 4. La cattura delle immagini automatica aumenta il throughput di schermi chimici drammaticamente 5,6. Schermi che la fluorescenza saggio automaticamente in zebrafish vivo spesso si basano su costosi, attrezzature specializzate. Cosiddetto screening ad alto contenuto offre il vantaggio di alta risoluzione, imaging quantitativo ma a costo di usare lettori di piastre specializzati attrezzati per microscopia confocale 7,8. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di dosaggio fluorescenza automaticamente tessuto-specifica in embrioni di zebrafishin una piastra a 96 pozzetti utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard. Fluorescenza tessuto-specifica può essere distinto con questa tecnica e può essere un approccio ragionevole per i laboratori che non hanno accesso ai lettori di piastre specializzati o apparecchiature ad alto contenuto di screening. In questo protocollo, utilizziamo l&#39;imaging automatizzato per rilevare il recettore degli estrogeni tessuto-specifica (ER) agonisti in zebrafish vivo in tre giorni dopo la fecondazione (dpf). La linea transgenica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contiene 5 tandem risposta estrogenica elemento sequenze di DNA (ERE) a monte della proteina fluorescente verde (GFP) 3. In assenza di ligando, ER sono normalmente inattive. Legame del ligando innesca un cambiamento conformazionale, che permette recettori legano il DNA ERE e regolano la trascrizione 9. 5xERE: pesce GFP possono essere usati per lo screening librerie chimiche per modulatori ER e possono essere usati per lo screening campioni di acqua ambientale per contaminanti estrogenici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

Embrioni di zebrafish sono un potente strumento per lo screening su larga scala di piccole molecole. Zebrafish transgenico che esprimono proteine ​​reporter fluorescenti sono spesso utilizzati per identificare le sostanze chimiche che modulano l&#39;espressione genica. Schermi chimici che saggio fluorescenza in zebrafish vivo spesso si basano su costosi, attrezzature specializzate per lo screening ad alto contenuto. Descriviamo una procedura utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard con un palco motorizzato per l&#39;immagine automaticamente embrioni di zebrafish e rilevare la fluorescenza tessuto-specifica. Utilizzando zebrafish transgenico che segnala l&#39;attività del recettore degli estrogeni attraverso l&#39;espressione di GFP, abbiamo sviluppato una procedura semi-automatica per schermare per ligandi del recettore degli estrogeni che attivano il giornalista in maniera tessuto-specifica. In questo video si descrivono le procedure per arraying embrioni di zebrafish a 24-48 ore dopo la fecondazione (HPF) in una piastra a 96 pozzetti e l&#39;aggiunta di piccole molecole che legano i recettori degli estrogeni. A 72-96 hpf, immagini di ogni bene dal&#39;intera piastra vengono raccolte automaticamente e controllato manualmente per fluorescenza tessuto-specifica. Questo protocollo dimostra la capacità di rilevare estrogeni che attivano i recettori in valvole cardiache ma non nel fegato.

La Figura 1 mostra immagini composite di singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Ogni immagine composita è composto di 59 immagini singole con 5% immagine sovrapposizione. Si noti che il zebrafish vivo sono orientati in modo casuale all&#39;interno di ogni bene, ma siamo in grado di distinguere la fluorescenza nel cuore dal fegato. Immagini Brightfield sono utili come riferimenti per valutare l&#39;orientamento zebrafish e visualizzare anomalie morfologiche (Figure 1A e 1C). Ima...

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Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Qui descritto è un protocollo per l&#39;imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Views.  University of Alabama at Birmingham.  Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish. 

Video: Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Ricerca

Biologia

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semiautomatici Analisi Heartbeat ottica di piccoli cuori

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell&#39;immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glicani Imaging in embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e Chimica Clicca Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...