Questa tecnica consente non solo la localizzazione, ma anche la quantificazione degli mRNA candidati nei singoli ovociti ed embrioni. Rispetto ad altri saggi, tra cui PCR, il completamento della tecnica si traduce in dati riproducibili con bassa variazione. A dimostrare la procedura sarà Kelsey Timme, una studentessa laureata nel mio laboratorio.
Inizia questa procedura con la preparazione del materiale richiesto e dei topi femmine a cinque-otto settimane di età come descritto nel protocollo di testo. Pulire il mouse utilizzando il 70% di etanolo. Esporre la cavità addominale e visualizzare il tratto riproduttivo femminile.
Tenere l'ovaia con le forcelle e rimuovere i legamenti uterina e il tessuto adiposo in eccesso da intorno all'ovaio. Tagliare l'ovidotto dall'utero. Quindi, posizionare la coppia di ovidotto ovaio in un mezzo di tenuta caldo in un piatto da 35 millimetri.
Rimuovere l'ovaio e qualsiasi tessuto adiposo circostante. Strappare l'ampolla gonfia dell'ovidotto usando un ago calibro 27 da mezzo pollice. Spingere l'ovidotto nel sito della lacrima e cumuli i complessi di ovocite cellulari saranno espulsi.
Uso di una pipetta per la bocca per trasferire gli ovociti ovulati alla goccia di 100 microliter contenente mezzo di contenimento con ialuronidasi. Per spodestare le cellule cumuli, pipettare la metafase due complessi cellulari cumuli di ovociti su e giù nell'ialuronidasi contenente il mezzo di contenimento con la pipetta della bocca. Una volta privi di cellule cumuli, utilizzare la pipetta della bocca per trasferire ogni ovocita in una goccia di lavaggio contenente solo mezzo di supporto.
Ripetere questa situazione per ogni goccioline di lavaggio. Non trasferire ovociti frammentati o trasparenti. Per eseguire la colorazione SM-FISH, fissare prima gli ovociti in un singolo pozzo di una piastra di sei pozzi contenente 500 microlitri di tampone di fissaggio.
Immergere 20 ovociti o meno nel pozzo. Incubare gli ovociti in tampone di fissazione per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato gli ovociti come descritto nel protocollo di testo, incubare gli ovociti nel tampone di permeablizzazione per 30 minuti a temperatura ambiente.
Dopo un altro lavaggio, trasferire gli ovociti a 80 microlitri di proteasi pre-diluita tre tamponi per 30 minuti a temperatura ambiente. Diluire i set di sonda riscaldati per Nanog, Pou5f1 e DapB da uno a 50 nel diluente della sonda. Incubare gli ovociti in 80 microlitri della sonda specifica della trascrizione per due ore a 40 gradi Celsius.
Quando gli ovociti sono nella sonda e nei buffer AMP, tendono a galleggiare. È essenziale immergere gli ovociti spingendoli delicatamente nel tampone. Trasferire gli ovociti in 500 microlitri di tampone di lavaggio e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Ora, incubare gli ovociti in sequenza nei tamponi di amplificazione. In primo luogo, incubare gli ovociti in 80 microlitri di AMP1 per 30 minuti a 40 gradi Celsius. Quindi trasferire gli ovociti a 500 microlitri di tampone di lavaggio per 10 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, incubare gli ovociti in 80 microlitri di AMP2 per 15 minuti a 40 gradi Celsius. Dopo aver lavato gli ovociti come prima, incubare gli ovociti in 80 microlitri di AMP3 per 30 minuti a 40 gradi Celsius seguiti da un lavaggio finale. Infine, aggiungere ovociti a 80 microlitri di AMP4FL per 15 minuti a 40 gradi Celsius.
Pipetta 12 microlitri di mezzo di montaggio anti dissolvenza al centro di una diapositiva senza aggiungere bolle al reagente. Trasferire gli ovociti con il meno tampone di lavaggio possibile nel mezzo di montaggio. Infine, applicare un foglietto di copertura.
Immagini gli ovociti tridimensionali usando la microscopia confocale in fase Z e salva le immagini come descritto nel protocollo di testo. Trascinare i file ND2 nelle Fiji e scegliere Hyperstack. Fare clic sulla scheda Immagine, selezionare Colore e fare clic su Dividi canali per separare i canali fluorescenti del file ND2.
Generare singoli file TIFF per ogni fetta Z degli ovociti in ogni canale fluorescente. A tal fine, fare clic sulla scheda Immagine, selezionare Stack e fare clic su Impila in immagini. Quindi, fare clic sulla scheda Immagine, selezionare Tipo e fare clic su Colore RGB per convertire ogni fetta Z in una singola immagine a colori RGB.
Salvare ogni immagine convertita come file TIFF. Posizionare le immagini da un singolo ovocita per ogni canale fluorescente in una nuova cartella per evitare confusione durante le cuciture. Dopo aver normalizzare i file come descritto nel protocollo di testo, fare clic sulla scheda Plug-in, selezionare Cucitura e fare clic su Raccolta griglia.
Selezionate Immagini sequenziali (Sequential Images) dal menu a discesa e fate clic su Ok (Okay). Sfoglia la directory e seleziona la cartella contenente tutte le immagini della sezione Z per un singolo ovocita a una lunghezza d'onda. Fare clic su Ok.
Spostare il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore dell'immagine cucita nel canale di colore appropriato per la lunghezza d'onda utilizzata. Creare l'immagine finale cucita RGB facendo clic su Immagine, selezionando Tipo e facendo clic su Colore RGB. Convertire l'immagine cucita in un'immagine proiettata massima a 32 bit.
A tal fine, fare clic su Immagine, digitare e fare clic su 32 bit. Salvare questa immagine come nuovo file TIFF. Apri l'immagine cucita a 32 bit in un programma di ricerca e tracciamento dei punti.
Selezionate l'elenco a discesa Localizza (Localize) e fate clic su Localizza (Localize), che calcolerà il numero di punti trovati nell'immagine. Qui è mostrata la quantificazione degli mRNA utilizzando il ricerca spot e il tracciamento. La freccia blu punta a un segnale positivo al di sopra della soglia.
La freccia bianca mostra una macchia fluorescente al di sotto della soglia e quindi non conteggiata. I conteggi degli mRNA sono stati successivamente analizzati utilizzando uno strumento standard di analisi dei dati. Immagini rappresentative dell'immagine centrale della serie Z sono mostrate per Pouf51 e Nanog.
Colorazione DAPI dei cromosomi allineati sulla metafase due mandrino è mostrata in bianco. I dati raccolti in questo protocollo mostravano 775 trascrizioni Pouf51 e 113 trascrizioni Nanog in metafase due ovociti. È importante sottolineare che non sono state rilevate macchie negli ovociti etichettati con sonda DapB, che fungeva da controllo negativo.
Quando si utilizzano cellule non aderenti, è importante identificare empiricamente la migliore diluizione del tampone di proteasi dal kit SM-FISH. Il rilevamento dell'mRNA è stato testato utilizzando una curva di titolazione di concentrazioni di proteasi non diluite e diverse concentrazioni diluite di tampone di proteasi in 1xPBS. La diluizione proteasi utilizzata in questo protocollo era da uno a otto in quanto mostrava la variazione più bassa nell'espressione fluorescente media di Pouf51 mRNA nella metafase di due ovociti.
L'immunofluorescenza simultanea di una proteina bersaglio può essere eseguita al fine di co-localizzare l'mRNA con una proteina legante l'RNA. La co-localizzazione degli mRNA con le proteine leganti l'RNA consente agli investigatori di determinare meccanismi che regolano la memorizzazione, la traduzione e la degradazione dell'mRNA all'interno di un ovocita o di un embrione.
