I nostri protocolli forniscono un punto di partenza per studi funzionali sullo sviluppo e la fisiologia delle lenti e per lo screening genetico inverso dei fenotipi delle lenti nel pesce zebra. I nostri protocolli ponteno analisi in vitro e in vivo della morfologia della membrana delle lenti zebrafish e forniscono un metodo nuovo e diretto per quantificare lo sviluppo dell'ottica delle lenti zebrafish. L'analisi della morfologia e dell'ottica delle lenti zebrafish porta a intuizioni sui meccanismi che controllano lo sviluppo delle lenti, la fisiologia normale e la fisiopatologia.
Queste intuizioni possono a loro volta portare alla capacità di ritardare o prevenire la cataratta. Non ci sono stati rapporti in specie diverse dal pesce zebra di nuclei lenti localizzati asimmetricamente. Identificare le suture delle lenti è fondamentale per orientare correttamente l'obiettivo per misurare la localizzazione del nucleo.
Dopo la conferma di una sedazione sufficiente con Tricaine, utilizzare le forbici a microdisezione per asportare immediatamente entrambi gli occhi da un adulto o da un pesce zebra larvale e posizionare entrambi gli occhi in una piastra di Petri su misura da 35 millimetri con uno stampo di dissezione in silicone riempito con PBS. Per raccogliere la lente da un zebrafish adulto, posizionare il lato posteriore dell'occhio verso l'alto e inserire le forcep con un angolo inferiore a 45 gradi attraverso il disco ottico. Usa le forbici di dissezione per fare due o tre incisioni radiali attraverso la retina e lo sclera dal disco ottico alla zona ciliaria nell'occhio immobilizzato e sbucciare la retina e lo sclera come petali di fiori.
Invertire l'occhio, lato cornea verso l'alto, e utilizzare il lato piatto delle forbici per immobilizzare l'obiettivo indirettamente attraverso la manipolazione della sclera e della cornea usando le forcelle per allontanare la retina e i tessuti attaccati, quindi tagliare con cura qualsiasi tessuto in eccesso dalla lente. Per la raccolta delle lenti zebrafish larvali, posizionare un lato posteriore dell'occhio larvale sulla parte piatta di un piatto di silicone di PBS e utilizzare un ago di tungsteno affilato per effettuare tagli radiali attraverso la retina e lo sclera immobilizzando l'occhio con un altro ago o pinza, quindi raccogliere delicatamente la lente dall'occhio dissociato con il lato smussato di un ago di filo di tungsteno su misura e allontanare con cura il tessuto attaccato. Per misurare la localizzazione del nucleo delle lenti dell'asse anteriore-posteriore, orientare le lenti appena asportate assialmente in PBS in un piatto da 35 millimetri con un fondo di vetro di copertura con i pali e le suture orientati parallelamente al piano di messa a fuoco.
Per identificare il nucleo dell'obiettivo, cercare una differenza nell'indice di rifrazione, che di solito si verifica all'interfaccia della corteccia dell'obiettivo e del nucleo dell'obiettivo. Se le suture dell'obiettivo non sono evidenti, una leggera leccata con forcep alla capsula dell'obiettivo rivela le suture e il nucleo dell'obiettivo, aiutando ad orientare l'obiettivo per la misurazione. Posizionare il piatto sul palco di un microscopio a dissezione dotato di una fotocamera e posizionare gli obiettivi con il nucleo dell'obiettivo a fuoco sotto illuminazione a campo luminoso o con ottiche a contrasto di interferenza differenziale.
Immagine di un micrometro con lo stesso ingrandimento per la calibrazione e fare clic su Visualizzazione live. Fare clic su Snapshot per ottenere un'immagine e salvare l'immagine come file TIFF. Per calibrare le immagini dell'obiettivo acquisite, in un programma software di elaborazione delle immagini appropriato, selezionare lo strumento linea retta e disegnare una linea di lunghezza nota sull'immagine del micrometro.
Fare clic su Analizza e imposta scala e immettere la distanza e le unità note, quindi selezionare Calibrazione globale e fare clic su OK. Per misurare la distanza dal centro del nucleo dell'obiettivo al polo anteriore, identificare la posizione della sutura dell'obiettivo e utilizzare lo strumento linea retta per disegnare una linea attraverso il centro immaginato del nucleo dell'obiettivo in orientamento assiale. Il centro di questa linea è il centro del nucleo dell'obiettivo. Disegnate un'altra linea da questo punto al polo anteriore dell'obiettivo e selezionate Misura (Measure) nel menu Analizza (Analyze) per misurare la distanza.
Disegnare un'altra linea dal polo anteriore al polo posteriore e misurare questa distanza come diametro dell'obiettivo, quindi copiare queste lunghezze dalla finestra Risultati in un foglio di calcolo e calcolare la localizzazione normalizzata del nucleo dell'obiettivo rispetto al raggio dell'obiettivo. Entro tre giorni dopo la fecondazione, le suture anteriori si formano al polo anteriore e la sorprendente convergenza delle cellule è chiaramente vista dalla colorazione della falloidina delle membrane cellulari a fibre strette in embrioni fissi. Un'etichettatura cellulare a fibra larga più forte nella membrana lente localizzata mApple transgenica consente la visualizzazione dal vivo dei sottodomini di membrana ma manca della convergenza suturale.
Le suture posteriori possono essere visualizzate sia in vitro che in vivo a tre giorni dopo la fecondazione. In un piano equatoriale, la falloidina etichetta fortemente le cellule esterne della fibra corticale, rivelando una forma esagonale appiattita. La phalloidina è esclusa dal nucleo dell'obiettivo compattato e il tipo selvaggio e l'obiettivo mutante sembrano indistinguibili.
La forte etichettatura di ampie cellule in fibra nei mosaici mApple localizzati nella membrana delle lenti transgenica rivela interruzioni nel volume cellulare all'interno della lente mutante. Poiché l'espressione transgena non è limitata dalla permeabilità, alcuni mosaici rivelano l'etichettatura del nucleo delle lenti. Negli animali di tipo selvatico, il nucleo della lente inizia più vicino al polo della lente anteriore durante le prime fasi di sviluppo prima di centralizzare durante l'età adulta.
Espressione di proteine con tag verde in un ospite transgenico in cui le membrane cellulari fluoresce rosso consentono la localizzazione simultanea delle proteine e la valutazione della morfologia delle cellule fibre in vivo. Gli zebrafish sono particolarmente adatti per studi in vivo. Utilizzando gli strumenti qui descritti, possiamo sondare i meccanismi delle lenti, in gran parte studiati in vitro, in un sistema in vivo.
