Ringraziamo tutti i membri attuali ed ex Kunkel Lab per il loro lavoro e discussioni relative al protocollo e riutilizzare i dati presentati qui. Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto Z01 ES065070 a T.A.K. dalla divisione di ricerca intramurale degli istituti nazionali di salute (NIH), National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS).

1. alcalino idrolisi e Strand-specifico del sud della macchia (Figura 1)
<ol><li>Crescita delle cellule e isolamento di DNA genomic<ol>
<li>Isolare il DNA genomico utilizzando un kit di purificazione di DNA seguendo le istruzioni del produttore del lievito lievito. Utilizzare le culture che sono in fase esponenziale di crescita tra (una densità ottica pari a 0,5) e 1. Risospendere il pellet di DNA finale in 35 mL di 1x buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)).</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di 5 mg/mL RNasi al DNA ed incubare per 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Precipitare il DNA utilizzando 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M (pH 5.2) e 2,5 volumi di etanolo al 100% per 20 min su ghiaccio.</li>
		<li>Centrifuga a 16.000 x g per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
		<li>Lavare la pallina due volte con 500 mL di etanolo al 70%. Rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
		<li>Asciugare il pellet sul banco e risospendere in 35 ml di 1x buffer di TE.</li>
		<li>Quantificare il DNA utilizzando un fluorimetro (Tabella materiali) con il dsDNA BR Assay kit.</li>
		<li>Precipitare 5 mg di DNA da ogni campione utilizzando 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M, volumi di pH 5.2 e 2.5 di 100% EtOH per un volume totale di 200 mL (aggiungere H2O, se necessario, ulteriori 5 mg di DNA è necessario se il controllo di gel neutro è necessario). Incubare in ghiaccio per 20 min.</li>
		<li>Centrifuga a 16.000 x g per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
		<li>Asciugare il pellet sul banco. Risospendere il DNA in 14 mL di H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Elettroforesi del gel e idrolisi alcalina<ol>
<li>Aggiungere 6 mL di 1 M di KOH e incubare a 55 ° C per 2 h.</li>
		<li>Incubare i campioni su ghiaccio per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere 4 mL di buffer di caricamento DNA alcalino 6x: 300mm KOH, 6 mM EDTA, pH 8.0, polysucrose 18% (Tabella materiali), 0,15% di verde di bromocresolo e 0,25% xilene cianolo FF.</li>
		<li>Eseguire il cast un gel alcalino che si compone di agarosio all'1%, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Utilizzare un pettine che permette di 24 mL di campione di DNA per essere caricato per corsia.</li>
		<li>Esegua il gel a temperatura ambiente in tampone di elettroforesi alcalina 1x: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Includere un marcatore DNA appropriato.</li>
		<li>Rotazione verso il basso i tubi brevemente e caricare l'intero 24 mL di campione in gel dell'agarosi alcalina. Elettroforesi per 30 min a 30 V, seguita da 18-20 h a 10 V.</li>
		<li>Neutralizzare il gel per 2 incubazioni di 45 minuti ciascuno, a temperatura ambiente con agitazione delicata in tampone di neutralizzazione i: 1 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl.</li>
		<li>Macchia di DNA immergendo il gel neutralizzato in 200 mL di acqua contenente una diluizione di 1/10.000 di macchia SYBR Gold per 2 h a temperatura ambiente con agitazione delicata.</li>
		<li>Visualizzare il DNA utilizzando un transilluminatore UV. Alcali-sensibilità aumentata provoca la comparsa di piccoli frammenti di DNA, che indica una maggiore densità di ribonucleotidi non riparati in DNA5.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferimento del sud<ol>
<li>Trasferimento del DNA dal gel alcalino alla membrana di nylon caricato positivamente in azione capillare10. Un esempio di come questo trasferimento può essere impostato è fornito in Sambrook e di Russell manuale di10.</li>
		<li>Immergere il gel alcalino per 15 min a temperatura ambiente in tampone di trasferimento alcalino: 0,4 M NaOH, NaCl di 1m.</li>
		<li>Bagnare la membrana di nylon (tagliata alla dimensione del gel) brevemente con acqua e poi in ammollo per 5 min in tampone di trasferimento alcalino.</li>
		<li>Impostare la piattaforma di trasferimento capovolgendo 3 bicchieri in vetro (100 mL) in un pirofila di vetro. Questo piatto deve essere leggermente più grande rispetto alla dimensione del gel dell'agarosi. Impostare una lastra di vetro sopra di loro.</li>
		<li>Drappo 2 grandi pezzi di 3mm CHR cromatografia su carta (tagliare alla misura della larghezza del gel più lati più lunghi che possono drappo sopra i bordi nel serbatoio tampone) sopra la lastra di vetro.</li>
		<li>Versare tampone alcalino trasferire sopra il libro di cromatografia e riempire a metà il piatto di vetro. Appianare le bolle usando una pipetta di vetro da 5 mL.</li>
		<li>Adagiarvi il gel dell'agarosi, ancora appianare le bolle. Circondata da tutti i bordi del gel con parafilm. Versare una piccola quantità di tampone alcalino di trasferire sul gel.</li>
		<li>Posizionare la membrana pre-impregnati in nylon sulla superficie del gel. Appianare le bolle.</li>
		<li>Bagnato 2 pezzi di carta tagliato nella misura del gel dell'agarosi. Sopra la membrana e appianare eventuali bolle.</li>
		<li>Collocare una grande pila di tovaglioli di carta (tagliati a dimensioni leggermente superiori rispetto il gel di agarosio) sulla parte superiore del panino di trasferimento. Posizionare con attenzione una lastra di vetro sopra gli asciugamani di carta. Aggiungere un oggetto ponderato verso l'alto (un libro con una massa di 400 g funziona bene).</li>
		<li>Lasciare che il trasferimento procedere durante la notte a temperatura ambiente.</li>
		<li>Attentamente smontare lo stack di trasferimento e immergere la membrana per 15 min a temperatura ambiente in tampone di neutralizzazione II: 0.5 M Tris-HCl, pH 7,2, NaCl di 1m.</li>
		<li>Crosslink il DNA per la membrana di nylon caricato utilizzando un reticolante UV. Posizionare la membrana nel reticolante e utilizzare l'impostazione di autocrosslink.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della sonda del sud Nota: L'approccio descritto qui per rilevare siti alcali-sensibile nella nascente leader-contro in ritardo-filo del filo del DNA si basa su un protocollo precedentemente pubblicato11. Per il nostro esperimento, il rilevamento viene eseguita presso il gene reporter URA3 che è stato inserito in uno dei due orientamenti (OR1 o OR2) adiacenti l'origine di replicazione di ARS306 sul cromosoma III (Figura 3A). La presenza di siti alcali-sensibile in DNA genomic di lievito è un indicatore di incorporazione ribonucleotide, permettendo l'uso di ribonucleotidi come biomarcatori del DNA polimerasi attività12,13,14. Questo approccio, utilizzando una sequenza di DNA adiacente per l'efficiente ARS306 origine di replicazione, destinazione dovrebbe essere suscettibile di altre posizioni genomiche e geni bersaglio pure.<ol>
<li>PCR-amplificare una 520-base di segmento di coppia del gene del reporter URA3 utilizzando la seguente coppia di primer: URA3-F1 (a 5 minuti-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) e URA3-R1 (a 5 minuti-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>Eseguire la reazione di PCR utilizzando 10-20 ng di DNA genomico di lievito come un modello, 4 μL di ogni primer (10 stock μM), 10 μL di 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 8 μL di miscela di dNTP (2,5 mM), 0,5 μL di Ex Taq DNA polimerasi (5 U / µ l) e regolare il volume finale di 100 μL con H2O.</li>
		<li>Eseguire il seguente programma PCR: 95 ° C per 5 min; 30 cicli di 95 ° C per 1 min, 55 ° C per 1 min, 72 ° C per 2 min; 72 ° C per 10 min e permanenza a 4 ° C.</li>
		<li>Purificare il prodotto PCR utilizzando un kit di purificazione di PCR ed eluire il DNA con 50 mL di H2O. Ciò può ora essere utilizzato come modello nella reazione radiolabeling.</li>
		<li>Utilizzare i seguenti primer per radiomarcatura strand-specifiche: uso URA3-A (a 5 minuti-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) per la visualizzazione di DNA che si accoppia alla sonda A. Ciò corrisponde al DNA nascente leader filo quando URA3 è in OR2 e tnascent lagging strand DNA quando URA3 è in OR1. Utilizzare URA3-B (a 5 minuti-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) per la visualizzazione di DNA nascente che accoppia alla sonda B. Ciò corrisponde al DNA nascente leader filo quando URA3 è in OR1 e nascente lagging strand DNA quando URA3 è in OR2 (Figura 3).<ol>
<li>Eseguire la reazione radiolabeling con 10-20 ng amplificato URA3 frammento come modello del DNA, 2 µ l di primer (stock 10 μM), 5 μL di 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 4 μL di dNTPs 2,5 mM (meno dCTP), 5 μL (50 μCi) di un -32P-dCTP , 0,5 μL di ExTaq DNA polimerasi (5 U / µ l) e regolare il volume finale di 50 μL con H2O. Esegui il seguente programma per radiomarcatura: 94 ° C per 5 min; 25 cicli di 94 ° C per 1 min, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 1 min; 72 ° C per 5 min e permanenza a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare una colonna di spin G-25 per rimuovere etichetta radioattivo non incorporata. Prima dell'aggiunta del campione radiomarcato, centrifugare la colonna per 1 min a 720 x g e togliele tampone pipettando. Caricare il prodotto di reazione radiomarcato e centrifugare per 2 min a 720 x g per eluire il probe marcato.</li>
		<li>Incubare a 95 ° C per 5 min denaturare la sonda immediatamente prima dell'ibridazione. Raffreddare brevemente su ghiaccio.</li>
	</ol></li>
	<li>Ibridazione del sud<ol>
<li>Rotoli la membrana a contatto col prodotto in una provetta di ibridazione e aggiungere 25 mL di tampone di ibridazione preparata al momento: tampone fosfato di sodio 0,5 M, pH 7.2, 7% sodio dodecil solfato (SDS), 1% albumina di siero bovino (BSA). Incubare a 65 ° C per 1-2 h con rotazione in un forno di ibridazione.</li>
		<li>Attentamente versare la soluzione e aggiungere 25 mL di tampone di ibridazione più la sonda radiomarcata. Incubare a 65 ° C per 16-18 h con rotazione.</li>
		<li>Versare la soluzione in un contenitore per rifiuti radioattivo. Eseguire 5 lavaggi di 5 minuti ciascuno, a temperatura ambiente con tampone fosfato di sodio di fosfato-SDS lavaggio soluzione i: 40 mM, pH 7,2, pH di 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 8.0.</li>
		<li>Eseguire 2 lavaggi di 15 minuti ciascuno, a 65 ° C con fosfato-SDS II di soluzione di lavaggio: tampone fosfato di sodio 40 mM, pH 7,2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>Rimuovere la membrana dal tubo dell'ibridazione con pinzette e posto in un protettore manicotto di plastica aperto. Coprire ed esporre a una piastra di imaging. Provare un numero di tempi che vanno da 4 h a 4D di esposizione differente.</li>
		<li>Se necessario, striscia e ri-sonda la macchia usando una sonda diversa circa 3 - 4 volte. Per mettere a nudo, incubare la membrana per 2 h a 65 ° C in 25 mL di una 50% formammide, 2 x SSPE soluzione. Nota: soluzione di riserva x SSPE 20: 3 M di NaCl, 0,2 M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7,4.</li>
		<li>Versare la soluzione in un contenitore per rifiuti radioattivo. Eseguire 2 lavaggi di 15 minuti ciascuno, a 65 ° C in fosfato-SDS II di soluzione di lavaggio.</li>
		<li>Controllare la membrana con un contatore Geiger e ripetere il protocollo "stripping" Se il segnale rimane.</li>
		<li>Eseguire la pre-ibridazione e ibridazione come descritto sopra.</li>
	</ol></li>
</ol>2. misurare il tasso di mutazione e specificità nei ceppi di S. cerevisiae
<ol><li>Preparare la coltura delle cellule<ol>
<li>Inoculare una colonia singola (colonie di 2-3 giorni a 30 ° C alla forma corretta dimensioni del prende di cellule di lievito sano) coltivata su agar YPD supplementato con adenina 100 mg/mL 5 mL di brodo YPDA completato con adenina di 250 mg/mL (il completamento di adenina è necessaria solo se il ceppo utilizzato è un auxotroph di adenina). Crescere in un incubatore shaker o in un rotatore a 30 ° C fino a quando la cultura raggiunge la saturazione (36-48 h per un ceppo senza un difetto di sviluppo severo).</li>
		<li>Rotazione verso il basso le cellule a ~ 2000 x g per 5 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante e lavare le cellule con 5 mL di acqua sterile.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 500 mL di acqua sterile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluizione della coltura delle cellule e placcatura<ol>
<li>Per i controlli non-selezione, diluire le cellule in una piastra a 96 pozzetti da un fattore di 1.600.000 e piastra 100 mL di ogni cultura in un piatto completo di (COM).</li>
		<li>Per selezionare per ura3 mutanti, piastra 100 mL di cellule non diluite su un piatto di 5-FOA per un ceppo di wild type (WT). Diluire le cellule di conseguenza se il tasso di mutazione del ceppo di interesse dovrebbe essere superiore a in un ceppo WT.</li>
		<li>Per selezionare per can1 mutanti, diluire 5 volte le cellule e piastra 100 mL su un piatto contenente canavanina (CAN) per un ceppo WT. Il fattore di diluizione è 0,5.</li>
		<li>Incubare le piastre a 30 ° C fino a forma di colonie del lievito. Per i ceppi senza un difetto di crescita, 2-3 giorni è di solito sufficiente per COM e può piastre e 3-5 giorni per piastre 5-FOA. Per confrontare i tassi di mutazione tra diversi ceppi, si consiglia di scegliere il giorno stesso della crescita per contare le colonie. Conservare le piastre pronte essere contato in camera fredda (~ 4 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolo del tasso di mutazione spontanea<ol>
<li>Contare le colonie visibili su ogni piatto e prendere nota dei numeri di Colonia</li>
		<li>Calcolare il tasso di mutazione usando la formula di Drake: μ = f ÷ ln (μNt). f è la frequenza di mutazione calcolata secondo il numero di mutanti diviso numero di cellule nella coltura finale. NT è il numero di cellule nella coltura finale e μ è il tasso di mutazione. Questa equazione può essere risolta con un metodo iterativo, ad esempio il metodo di Newton-Raphson. Ci sono altri metodi per la stima, compresa la prova di Lea e Coulson, per calcolare il tasso di mutazione15.</li>
		<li>Calcolare l'intervallo di confidenza assumendo registro distribuzione normale delle tariffe reputazione dei singoli isolati. L'intervallo di confidenza del 95% è più spesso utilizzato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi dello spettro di mutazione<ol>
<li>Scegliere una singola Colonia da ogni 5-FOA o può placcare e aggiornare su un piatto YPDA.</li>
		<li>Eseguire la PCR per amplificare il gene URA3 o CAN1 e la sequenza al fine di rilevare le mutazioni utilizzando i seguenti primer della Colonia: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') e URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') per entrambi l'amplificazione di PCR e sequenziamento del gene URA3 bp 800; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') e CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') per l'amplificazione e CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') e (CAN1-BR 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') per il sequenziamento del gene reporter CAN1 bp 1800.</li>
		<li>Per eseguire la PCR della Colonia, risospendere una singola Colonia in 5 μL di H2O e 1 μL di utilizzare come modello. Aggiungere 1 μL di ciascuno dei primer (5 stock μM), 2 μL di tampone di x KAPA2G 5 (Mg2 + plus), 0,5 μL di dNTP (2,5 mM), 0,5 μL di KAPA2G veloce DNA polimerasi, 12 μL di H2O.</li>
		<li>Per l'amplificazione del gene URA3 , eseguire il seguente programma PCR: 95 ° C per 5 min; 5 cicli di 95 ° C per 10 s, 61 ° C per 15 s, 72 ° C per 30 s; 35 cicli di 95 ° C per 10 s, 61 ° C per 15 s, 72 ° C per 30 s; 72 ° C per 2 min e permanenza a 4 ° C. Per l'amplificazione del gene CAN1 , eseguire il seguente programma PCR: 95 ° C per 5 min; 5 cicli di 95 ° C per 10 s, 61 ° C per 15 s, 72 ° C per 45 s; 35 cicli di 95 ° C per 10 s, 61 ° C per 15 s, 72 ° C per 45 s; 72 ° C per 2 min e permanenza a 4 ° C.</li>
		<li>Allineare i risultati del sequenziamento di una sequenza di riferimento utilizzando un programma come DNASTAR Seqman Pro o Sequencher per identificare mutazioni.</li>
		<li>Compilare i dati di mutazioni di tipo di mutazione (Figura 4) o mutazione posizione (Figura 5). Calcolare le tariffe di mutazione specifica per la frequenza di mutazione (il numero degli eventi osservati diviso per numero di mutanti sequenziati) moltiplicano per il tasso di mutazione globale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+sugar:+how+polymerases+select+a+nucleotide+substrate.">Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases.">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).</li><li>Sparks, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+consequences+of+putative+active+site+mutations+in+yeast+DNA+polymerases+alpha,+epsilon,+delta,+and+zeta.">In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta.</a> Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).</li><li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+{alpha}+and+{delta}.">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li><li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon.">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity.">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).</li><li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development.">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition.">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, descriviamo i protocolli per due serie di esperimenti che vengono spesso utilizzati per analizzare semi-quantitativamente ribonucleotidi incorporati durante la replicazione del DNA e gli effetti mutageni di ribonucleotidi non riparati. Sebbene questi approcci comportano eucariote il modello S. cerevisiae, queste tecniche possono essere facilmente adattate ad altri microbi e persino più alti eucarioti.
Sondaggio per ribonucleotidi non riparati nel DNA usando l'elettroforesi alcal...

Durante la replicazione nucleare eucariotiche, ribonucleotidi sono incorporati nel genoma di tutti i tre principali replicases di DNA, DNA polimerasi (Pols) α, ε e δ1,2. Riparazione per escissione RNasi H2-dipendente ribonucleotide (RER3) rimuove la maggior parte di questi ribonucleotidi incorporati.
Un ribonucleotide nel DNA è suscettibile di idrolisi, come il gruppo dell'idrossile 2' della parte dello zucchero in grado di attaccare il legame fosfodiesterico adiacente, rilasciando un'estremità con un 2' - 3' fosfato ciclico e l'altra con un 5'-OH4. Condizioni alcaline possono notevolmente accelerare questa reazione. Così, l'idrolisi di ribonucleotidi incorporati durante l'incubazione in una soluzione di base provoca la frammentazione del DNA genomico, che possa essere visualizzata da alcalino-agarosio elettroforesi5. Questo DNA può essere trasferito ad una membrana e sondato dall'analisi del sud della macchia usando sonde di strand-specific che permettono l'identificazione dei siti alcali-sensibile causato da ribonucleotidi incorporati nel nascente leader - o in ritardo-filo del DNA, rispettivamente.
In cellule di lievito che difetta dell'attività RNasi H2, rimozione di ribonucleotidi può essere avviato quando topoisomerasi io (Top1) Nick il DNA al incorporato ribonucleotide6,7. Tuttavia, quando Top1 si unirà sul lato 3' della ribonucleotide, questo genera 5'-OH e 2' - 3' fosfato ciclico DNA finisce che sono refrattari alla religation. La mancata riparazione o l'elaborazione aberrante di questi 'estremità sporca' può portare a instabilità genomica. Inoltre, se l'incisione avviene all'interno di una sequenza ripetuta di DNA, il processo di ripristino può portare a mutazioni di omissione. Ciò è particolarmente problematico per ripetizioni in tandem, dove breve eliminazioni (di tra due e cinque coppie di basi) sono comunemente osservati in cellule RNasi H2-carenti. Gli effetti deleteri di Top1-dipendente in assenza di lievito RNasi H2 attività sono aggravate in un mutante ε di DNA polimerasi (pol2-M644G) promiscuo per incorporazione ribonucleotide durante la sintesi di filo leader nascente.
Elaborazione di ribonucleotidi in DNA conduce a mutazioni spontanee e la mutagenesi può essere rilevata utilizzando geni reporter appropriato e selezionando per il cambiamento fenotipico accompagnamento. Un test di fluttuazione o esperimento Luria e Delbrück è uno dei metodi più comunemente usati per misurare i tassi di mutazione spontanea utilizzando geni reporter selezionabile8,9. In lievito, i geni URA3 e CAN1 possono essere utilizzati come reporter nel test di mutazione in avanti, che consente il rilevamento di tutti i tipi di mutazione che provocano la perdita della funzione del gene. Il tasso di mutazione spontanea è stimato come la mediana di quello osservato per più culture parallele iniziate dalle singole colonie senza mutazioni del gene del reporter di destinazione. Un lievito ceppo RNasi H2-carente come rnh201Δ ha un tasso di mutazione spontanea nel complesso moderatamente elevato che è in gran parte causato da un'elevata incidenza di 2-5 eliminazioni di bp in tandem ripetere sequenze. Così, per caratterizzare completamente gli effetti mutageni di ribonucleotidi nel genoma, tassi di mutazione specifico necessario determinare. In questo caso, i geni reporter URA3 o CAN1 possono essere amplificati ed ordinati per determinare i tipi e le posizioni delle mutazioni, e tassi di mutazione specifica possono essere calcolati. Compilazione di mutazioni identificate in mutanti URA3 o CAN1 indipendenti multipli quindi può essere utilizzata per generare uno spettro di mutazione.

<table><tbody><tr><td>YPD media</td><td></td><td></td><td>20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.</td></tr><tr><td>COM plates</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 &amp;ndash; 35 ml per plate.</td></tr><tr><td>CAN plates</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 &amp;deg;C and cool down to 56 &amp;deg;C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.</td></tr><tr><td>5-FOA plates</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 &amp;deg;C and cool down to 60 &amp;deg;C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.</td></tr><tr><td>L-Canavanine sulfate</td><td>US Biological</td><td>C1050</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>US Biological</td><td>F5050</td><td></td></tr><tr><td>20 mL glass culture tube</td><td></td><td></td><td>Any brand</td></tr><tr><td>Culture rotator in 30 &amp;deg;C incubator</td><td></td><td></td><td>Shaker incubator can be used instead</td></tr><tr><td>96 well round bottom plates</td><td></td><td></td><td>Sterile, any brand</td></tr><tr><td>3 mm glass beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>12-channel pipettes</td><td></td><td></td><td>Any brand</td></tr><tr><td>Ex Taq DNA Polymerase</td><td>TaKaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit</td><td>Epicenter</td><td>MPY80200</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>Newer model available</td></tr><tr><td>dsDNA BR Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSF10400</td><td></td></tr><tr><td>Bromocresol green</td><td>Eastman</td><td>6356</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol FF</td><td>International Technologies Inc.</td><td>72120</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>Teknova</td><td>T5080</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>UV transilluminator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Nylon membrane Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>3 MM CHR Chromotography paper</td><td>Whatman</td><td>3030-392</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>G-25 spin column</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (S9638);&lt;br/&gt; Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (S9390)</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>Geiger counter</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studying ribonucleotide incorporation: strand-specific detection of ribonucleotides in the yeast genome and measuring ribonucleotide-induced mutagenesis

La presenza di ribonucleotidi in DNA nucleare ha dimostrata di essere una fonte di instabilità genomica. La misura dell'incorporazione del ribonucleotide può essere valutata da idrolisi alcalina ed elettroforesi su gel come RNA è altamente suscettibile di idrolisi in condizioni alcaline. Questo, in combinazione con l'analisi del sud della macchia può essere utilizzato per determinare la posizione e filo in cui sono stati incorporati i ribonucleotidi. Tuttavia, questa procedura è solo semi-quantitativa e potrebbe non essere abbastanza sensibile da rilevare piccole variazioni nel contenuto ribonucleotide, sebbene filo specifico del sud della macchia di sondaggio migliora la sensibilità. Come misura di uno delle conseguenze biologiche più eclatante di ribonucleotidi nel DNA, mutagenesi spontanea possono essere analizzata usando un'analisi di mutazione in avanti. Utilizzando i geni reporter appropriato, mutazioni rare che comporta la perdita della funzione possono essere selezionata e nel complesso e tassi di mutazione specifica possono essere misurati mediante la combinazione di dati provenienti da esperimenti di fluttuazione con sequenziamento del DNA del gene del reporter. Il test di fluttuazione è applicabile per esaminare un'ampia varietà di processi mutageni in background genetico specifico o le condizioni di crescita.

Trattamento del DNA genomico con alcali seguita da elettroforesi alcalina permette di rilevazione semi-quantitativa della frammentazione del DNA a causa dell'abbondanza di ribonucleotidi stabilmente incorporati. La figura 2 Mostra le immagini di gel di lievito DNA genomic trattato con o senza KOH5. La variante M644L del Pol2, la subunità catalitica della Polε, ha ridotto la capacità di incorporare ribonucleotidi, mentre il mutante M...

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Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Ribonucleotidi sono tra i più abbondanti nucleotidi non canonico incorporati nel genoma durante la replicazione del DNA nucleare negli eucarioti. Se non correttamente rimosso, ribonucleotidi possono causare mutagenesi e danno del DNA. Qui, presentiamo due approcci sperimentali che sono utilizzati per valutare l'abbondanza di incorporazione ribonucleotide del DNA e dei suoi effetti mutageni.

Studiare Ribonucleotide incorporazione: Strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da Ribonucleotide di misura

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.7K Views.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS. Ribonucleotidi sono tra i più abbondanti nucleotidi non canonico incorporati nel genoma durante la replicazione del DNA nucleare negli eucarioti. Se non correttamente rimosso, ribonucleotidi possono causare mutagenesi e danno del DNA. Qui, presentiamo due approcci sperimentali che sono utilizzati per valutare l'abbondanza di incorporazione ribonucleotide del DNA e dei suoi effetti mutageni.

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Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Ricerca

Biochimica

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetica

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of different functional assays to study the impacts of 1) binding site [i.e., response element (RE)] sequence variants on P53 transactivation specificity or 2) TP53 mutations, co-expressed cofactors, or small molecules on P53 transactivation activity. Different basic and translational research applications have been developed. Experimentally, these approaches exploit two major advantages of the yeast model. On one hand, the ease of genome editing enables quick construction of qualitative or quantitative reporter systems by exploiting isogenic strains that differ only at the level of a specific P53-RE to investigate sequence-specificity of P53-dependent transactivation. On the other hand, the availability of regulated systems for ectopic P53 expression allows the evaluation of transactivation in a wide range of protein expression. Reviewed in this report are extensively used systems that are based on color reporter genes, luciferase, and the growth of yeast to illustrate their main methodological steps and to critically assess their predictive power. Moreover, the extreme versatility of these approaches can be easily exploited to study different TFs including P63 and P73, which are other members of TP53 gene family.

Presented here are four protocols to construct and exploit yeast Saccharomyces cerevisiae reporter strains to study human P53 transactivation potential, impacts of its various cancer-associated mutations, co-expressed interacting proteins, and the effects of specific small molecules.

Il lievito come telaio per lo sviluppo di saggi funzionali per studiare l'Uomo P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Ricerca sul cancro

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Analisi nonradioattiva per misurare la fosforilazione polinucleoide dei substrati piccoli nucleotidi

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Studi genetici di proteine ​​umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biologia

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in higher eukaryotes may promiscuously recognize other RNA species and 2&#8217;-O-methylate multiple targets. Here, we provide step-by-step guide for the fast and non-expensive analysis of the site-specific 2&#8217;-O-methylation using a well-established method employing short DNA oligonucleotides called DNAzymes. These DNA fragments contain catalytic sequences which cleave RNA at specific consensus positions, as well as variable homology arms directing DNAzyme to its RNA targets. DNAzyme activity is inhibited by 2-&#8217;O-methylation of the nucleotide adjacent to the cleavage site in the RNA. Thus, DNAzymes, limited only by the consensus of the cleaved sequence, are perfect tools for the quick analysis of snoRNA-mediated RNA 2&#8217;-O-methylation. We analyzed snoRNA snR13- and snR47-guided 2&#8217;-O-methylation of 25S ribosomal RNA in Saccharomyces cerevisiae to demonstrate the simplicity of the technique and to provide a detailed protocol for the DNAzyme-dependent assay.

Here we present a protocol for DNAzyme-dependent cleavage of RNA. This enables fast and site-dependent analysis of RNA 2&#8217;-O-methylation. This approach can be used for the preliminary or major assessment of snoRNA activity.

Analisi dipendente da DNAzyme del rRNA 2'-O-Metilazione

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

Biologia dello sviluppo

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Misura di mRNA Decay Prezzi in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilizzo<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Ceppi

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

Mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del DNA mitocondriale umano

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Studiare Ribonucleotide incorporazione: Strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da Ribonucleotide di misura

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Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Il lievito come telaio per lo sviluppo di saggi funzionali per studiare l'Uomo P53

Analisi nonradioattiva per misurare la fosforilazione polinucleoide dei substrati piccoli nucleotidi

Studi genetici di proteine umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello

Analisi dipendente da DNAzyme del rRNA 2'-O-Metilazione

Misura di mRNA Decay Prezzi in

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in

Mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del DNA mitocondriale umano

Studiare Ribonucleotide incorporazione: Strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da Ribonucleotide di misura

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