Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH): RO1 EY012085 (a J.X.J) e F32DK134051 (a FMA) e dalla sovvenzione della Welch Foundation: AQ-1507 (a J.X.J.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Le figure sono state parzialmente create con Biorender.com.

Questo studio è stato condotto in conformità con la legge sul benessere degli animali e i regolamenti di attuazione sul benessere degli animali in conformità con i principi della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Università del Texas Health Science Center di San Antonio. Per una panoramica del protocollo, vedere la Figura 1; vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig01.jpg"> Figura 1: Schema sperimentale. 1 . La prima fase del protocollo è la determinazione di una specifica proteina bersaglio, l'identificazione delle sequenze geniche associate e la generazione di frammenti di DNA. 2 . Clonazione della sequenza o delle sequenze geniche in un vettore retrovirale mediante clonazione iniziale in un vettore adattatore, 3. seguita da un vettore virale . 4 . Preparazione di particelle virali ad alto titolo utilizzando celle di impacchettamento per la raccolta e la concentrazione. 5 . La fase finale, e l'obiettivo di questo protocollo, è la microiniezione di particelle virali RCAS(A) nel lume della lente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
1. Preparazione di retrovirus ricombinanti ad alto titolo
<ol><li>Reazione a catena della polimerasi (PCR) per produrre frammenti di DNA proteico bersaglio NOTA: Questa sezione ha lo scopo di amplificare la sequenza di DNA corrispondente alla proteina del cristallino bersaglio. Per maggiori dettagli, vedere 7,8.<ol><li>Progettare primer per PCR, corrispondenti alla proteina di interesse, per realizzare frammenti di DNA con i loro termini carbossilici in-frame con o senza una sequenza di epitopi FLAG (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), un codone di stop e un sito enzimatico di restrizione (i.e., EcoRI) presente all'interno della regione polylinker di CLa12NCO)) secondo le specifiche indicate nei protocolli precedentemente pubblicati, con sequenze per enzimi di restrizione adeguati1, 7,8,10,11.</li>
		<li>Eseguire la reazione PCR10. Combinare 100 pmol di senso e antisenso dei primer progettati con 0,5 μg di cDNA connexina (come combinazioni Cx50, Cx43 o chimeriche Cx50*43L), al tampone di reazione PCR di scelta. Eseguire 30 cicli ciascuno composto da 94 °C per 1 min, 58 °C per 1 min e 72 °C per 1 min, seguiti da un'estensione finale per 10 min a 72 °C.</li>
		<li>Isolare e purificare i prodotti PCR con un kit di purificazione in gel.</li>
		<li>Digerire i prodotti PCR purificati utilizzando enzimi di restrizione di scelta secondo le istruzioni del produttore.</li>
	</ol></li>
	<li>Clonazione di inserti di DNA in plasmidi adattatori NOTA: L'inserimento di frammenti di DNA in un vettore adattatore elimina la necessità di cellule helper/virus per aumentare la stabilità del vettore RCAS(A)14. Per maggiori dettagli, vedere 7,8.<ol><li>Subclonare i frammenti di DNA in un plasmide adattatore, Cla12NCO, utilizzando una reazione di legatura adesiva. Miscelare i frammenti di PCR con enzimi di restrizione e Cla12NCO in un rapporto di 2-5:1. Eseguire la legatura e la trasformazione del DNA utilizzando cellule competenti.</li>
		<li>Isolare il DNA utilizzando un kit di isolamento del DNA.</li>
		<li>Sequenziare il DNA per garantire l'accuratezza.</li>
	</ol></li>
	<li>Clonazione nel vettore virale RCAS(A) NOTA: I frammenti di DNA vengono inseriti in un veicolo (retrovirus RCAS(A)) per la trasduzione stabile di un gene nelle cellule dell'embrione di pulcino in via di sviluppo14,15. Per maggiori dettagli, vedere 7,8,15.<ol><li>Digerire il frammento di DNA Cla12NCO-del vettore contenente interesse con ClaI (1 unità per 1 μg di DNA) e isolare con gel i frammenti.</li>
		<li>Subclonare i frammenti di DNA in un plasmide RCAS(A) linearizzato ClaI. Utilizzare l'enzima di restrizione SalI per distinguere il sito ClaI sul plasmide RCAS(A).</li>
		<li>Confermare il corretto orientamento dei frammenti inseriti sui costrutti mediante digestione con enzimi di restrizione ClaI e SalI.</li>
		<li>Isolare il DNA utilizzando un kit di isolamento del DNA.</li>
		<li>Determinare la concentrazione di DNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasfezione di cellule di fibroblasti embrionali di pulcino (CEF) e raccolta di RCAS(A) NOTA: Le cellule di impacchettamento del virus, CEF, vengono utilizzate per ottenere/raccogliere terreni di coltura cellulare contenenti particelle virali15,16. Per maggiori dettagli, vedere 7,8,15.<ol><li>Trasfettare cellule CEF con costrutti di DNA retrovirale ricombinante utilizzando l'agente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Eseguire il western blotting delle cellule trasfettate per esaminare la loro espressione della proteina di interesse.</li>
		<li>Quando le cellule trasfettate raggiungono la confluenza, iniziare a raccogliere il mezzo surnatante, elaborarlo/filtrarlo in modo appropriato (per rimuovere eventuali detriti cellulari utilizzando un filtro da 0,22 μm) e conservare a -80 °C fino al momento della concentrazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Concentrazione e titolazione delle scorte virali NOTA: Il pellet e i grandi volumi di terreno derivati dalle cellule contenenti le particelle virali devono essere filtrati. Inoltre, è necessario eseguire un test del titolo virale per stabilire la forza del virus contro le cellule ospiti. Per maggiori dettagli, vedere 6,7,8,15.<ol><li>Scongelare i terreni di coltura contenenti i virioni.</li>
		<li>Centrifugare il terreno di coltura a 72.000 × g per 2 ore a 4 °C.</li>
		<li>Decantare il surnatante e risospendere il pellet virale con il terreno residuo (~50 μL) e conservare a -80 °C fino all'uso, in ceppi virali da ~10 μL.</li>
		<li>Per la titolazione, utilizzando cellule QT-6 o CEF, trasfettare le cellule con una diluizione seriale delle scorte virali.</li>
		<li>Dopo la confluenza, fissare le cellule utilizzando il 4% di formaldeide.</li>
		<li>Immunocolorazione per proteine gag virali o processo istochimico per fosfatasi alcalina per ottenere il titolo, definito come (unità formanti colonie) CFU per millilitro (CFU/mL).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig02.jpg"> Figura 2: Strumenti e configurazione per la microiniezione con lente di pulcino . (A) Estrattore manuale per micropipette a microelettrodo verticale P-30. (1) riquadro che mostra una micropipetta di vetro che viene estratta. (B) (2) Incubatrice per uova. Incubare l'uovo di gallina per ~65-68 ore in un'incubatrice a 37 °C per raggiungere lo stadio 18 (con lume centrale sigillato e vuoto) per l'iniezione del retrovirus. (C) Configurazione della microiniezione. (3) apparecchiature di illuminazione, (4) Pico-Injector, (5) microscopio da dissezione, (6) micromanipolatore Drummond, (7) computer/telecamera per la visualizzazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. Microiniezione di lenti per pulcini
<ol><li>Preparazione delle forniture<ol><li>Preparazione di micropipette di vetro per microiniezione17 NOTA: I capillari in vetro vengono utilizzati per realizzare micropipette in vetro con punta e diametro esterno (OD) di ~11 μm per microiniezione. La configurazione è illustrata nella Figura 2A.<ol><li>Fissare il capillare in vetro borosilicato alle clip imbottite in gomma nell'estrattore verticale manuale per micropipette.</li>
			<li>Impostare la temperatura di calore (HEAT 1) a 950 °C ed eseguire il prepull per ottenere un capillare di vetro più sottile e morbido.</li>
			<li>Impostare la temperatura di calore (HEAT 2) a 790 °C ed eseguire un pull secondario per produrre le micropipette finali.</li>
			<li>Con un macinatore per micropipette, affilare l'apertura del puntale fino a un diametro esterno di ~11 μm.</li>
			<li>Per esperimenti futuri, conservare le micropipette di vetro in un tampone di serraggio di spugna all'interno di un barattolo di vetro.</li>
		</ol></li>
		<li>Incubazione di uova fecondate fino allo stadio di sviluppo 18 NOTA: Durante lo sviluppo del cristallino, a ~65-68 h di sviluppo embrionale, il cristallino si separa dall'ectoderma e forma una vescicola sigillata con un lume centrale; L'iniezione in questo lume vuoto della lente innesca per un'espressione limitata alle cellule proliferativedel cristallino 7,8,18.<ol><li>Incubare uova di gallina fecondate per ~65-68 h in un'incubatrice a basculante umidificata a 37 °C (Figura 2B).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Apertura dell'uovo di gallina NOTA: Questa fase descrive l'identificazione e l'esposizione dell'embrione per la microiniezione. Per maggiori dettagli, vedere 7,8.<ol><li>Pulire accuratamente l'area di lavoro con etanolo al 70%.</li>
		<li>Togliete le uova dall'incubatrice, spruzzatele abbondantemente con etanolo al 70% e lasciatele asciugare all'aria.</li>
		<li>Metti l'uovo, con l'estremità più grande rivolta verso l'alto, su un portauova.</li>
		<li>Usando un paio di pinze a denti affilati, produrre un foro di ~2 cm di diametro sull'estremità più grande dell'uovo picchiettando con cura sul guscio dell'uovo e rimuovendo i frammenti del guscio dell'uovo (Figura 3A).</li>
		<li>Usando un microscopio da dissezione, localizza l'embrione.</li>
		<li>Una volta individuato l'embrione e la lente del pulcino, utilizzare il microscopio da dissezione e le pinze e le forbici da dissezione fine per tagliare la membrana amnionica che copre immediatamente la parte superiore dell'embrione (Figura 3B). NOTA: Non tagliare troppo (solo quanto basta per esporre l'embrione ~0,5 cm x 0,5 cm), altrimenti gli embrioni potrebbero affondare nella massa vitellina; Evitare anche di toccare i vasi sanguigni, se possibile.</li>
		<li>Coprire l'apertura dell'uovo con una capsula di Petri da 60 mm in preparazione dei passaggi successivi.</li>
	</ol></li>
	<li>Microiniezione di stock virale concentrato NOTA: Le particelle virali contenenti frammenti di DNA proteico bersaglio per la trasduzione vengono inserite nelle cellule all'interno del lume del cristallino. La configurazione è illustrata nella Figura 2C. Per maggiori dettagli, vedere 6,7,8.<ol><li>Scongelare le scorte virali sul ghiaccio.</li>
		<li>Per visualizzare lo stock virale durante l'iniezione, diluire 1 μL di 10x Fast green in un flaconcino di stock virale contenente 10 μL.</li>
		<li>Per garantire che non vi siano grossi pezzi di materiale non disciolto che potrebbero ostruire la micropipetta di vetro, centrifugare le soluzioni per 10 s a 10.000 × g a 4 °C per pellettare "pezzi grandi" e trasferire i surnatanti in nuove provette, il tutto mantenendo le soluzioni in ghiaccio.</li>
		<li>Su una piastra di coltura di 35 mm x 10 mm, posizionare un parafilm da laboratorio allungato e aggiungere 1 μL di soluzione fisiologica sterile (PBS) sopra la pellicola (non sterilizzata, con il lato coperto considerato "pulito").</li>
		<li>Collegare una micropipetta di vetro preparata a un pico-iniettore automatico.</li>
		<li>Premere la modalità di riempimento per riempire la soluzione fisiologica sterile (PBS) in una micropipetta di vetro, quindi utilizzare la modalità di iniezione per testare il liquido da 1 μL assegnato.</li>
		<li>Posizionare un secondo parafilm da laboratorio allungato sulla superficie di una nuova piastra di coltura cellulare da 35 mm x 10 mm e aggiungere 1 μL di stock virali colorati in verde Fast sopra la pellicola.</li>
		<li>Abbassare la punta della micropipetta nello stock virale e premere il modello di riempimento per riempire la micropipetta di vetro con ~1 μL di stock virale. NOTA: Per evitare che si secchi, mettere la punta della micropipetta riempita in soluzione fisiologica sterile (PBS) ogni volta che c'è una pausa nella procedura.</li>
		<li>Abbassare la micropipetta di vetro riempita, collegata a un iniettore automatico, nella regione target del lume del cristallino dell'embrione con l'aiuto di un microscopio da dissezione.</li>
		<li>Regolare la sorgente luminosa per garantire una chiara visualizzazione del contorno della vescicola dell'obiettivo. NOTA: Il lume del cristallino destro (rivolto verso l'alto) viene in genere utilizzato per l'iniezione e il sinistro (rivolto verso il basso) viene mantenuto intatto come controllo controlaterale.</li>
		<li>Una volta accertati che il posizionamento della micropipetta si trovi nella posizione corretta all'interno del lume del cristallino, iniettare 5-40 nL del materiale virale (Figura 3C). NOTA: La pratica è molto necessaria per un posizionamento ottimale dell'iniezione.</li>
		<li>Attendere ~45 s e poi rimuovere delicatamente la micropipetta di vetro.</li>
		<li>Verificare l'esito positivo della microiniezione nel lume della lente utilizzando il microscopio da dissezione esaminando il colorante Fast Green che dovrebbe rimanere nel lume vuoto della lente senza alcuna perdita.</li>
		<li>Dopo la procedura di iniezione, sigillare l'apertura del guscio d'uovo con nastro adesivo.</li>
		<li>Rimettere l'embrione nell'incubatrice umidificata a 37 °C, senza alcun movimento rotatorio, fino al raggiungimento dell'età embrionale desiderata per la dissezione del cristallino.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig03.jpg"> Figura 3: Preparazione e schema del pulcino con microiniezione . (A) Apertura di un uovo di gallina. (B) Taglio della membrana amniotica. (C) Schema di microiniezione del lume della lente di pollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Studiare l'espressione proteica durante lo sviluppo del cristallino di pollo

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+the+lens+epithelial+explant+system+to+study+lens+differentiation+and+cataractogenesis.">Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).</li><li>Upreti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+epithelial+explants+treated+with+vitreous+humor+undergo+alterations+in+chromatin+landscape+with+concurrent+activation+of+genes+associated+with+fiber+cell+differentiation+and+innate+immune+response.">Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response.</a> Cells. 12 (3), 501 (2023).</li><li>Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+SRC+kinases+signals+induction+of+posterior+capsule+opacification.">Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).</li><li>Briskin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+retroviral+transgenes+are+highly+expressed+in+chickens.">Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).</li><li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS+vector+system.">The RCAS vector system.</a> Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).</li></ol>

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Questo modello sperimentale offre l'opportunità di esprimere la/e proteina/e di interesse nel cristallino intatto, portando allo studio della rilevanza funzionale di queste proteine nella struttura e nella funzione del cristallino. Il modello di microiniezione del pulcino embrionale si basa in parte sul lavoro di Fekete et. al.6 ed è stato ulteriormente sviluppato da Jiang et. al.8 ed è stato utilizzato come mezzo per inserire sia plasmidi virali che agenti come agonisti...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere la metodologia di microiniezione embrionale di lenti di pollo di un RCAS(A) (sarcoma/leucosi retrovirale A competente per la replicazione). È stato dimostrato che l'efficace somministrazione retrovirale in una lente embrionale di pollo è uno strumento promettente per lo studio in vivo del meccanismo molecolare e della struttura-funzione delle proteine della lente nella normale fisiologia del cristallino, nelle condizioni patologiche e nello sviluppo. Inoltre, questo modello sperimentale potrebbe essere utilizzato per l'identificazione di bersagli terapeutici e lo screening farmacologico per condizioni come la cataratta congenita umana. Nel complesso, questo protocollo mira a delineare i passi necessari per lo sviluppo di una piattaforma personalizzabile per lo studio delle proteine del cristallino.
I pulcini embrionali (Gallus domesticus), a causa della loro somiglianza nella struttura e nella funzione del cristallino con il cristallino umano, sono un modello animale ben consolidato per lo studio dello sviluppo e della fisiologia del cristallino 1,2,3,4. L'uso di un retrovirus aviario RCAS(A) competente per la replicazione è stato considerato un sistema altamente efficace, rapido e personalizzabile per esprimere proteine esogene negli embrioni di pulcino. In particolare, ha una capacità unica di confinare il trasferimento genico bersaglio alle cellule proliferative della fibra del cristallino senza la necessità di promotori tessuto-specifici, utilizzando l'esclusivo lasso di tempo di sviluppo embrionale in cui la presenza di lume del cristallino vuoto consente la microiniezione in situ di RCAS(A) nel sito ristretto per l'espressione di proteine esogene all'interno delle cellule proliferative della fibra del cristallino5, 6,7,8.
La procedura di microiniezione dell'embrione di pulcino, qui descritta in modo approfondito, si basa originariamente in parte sul lavoro di Fekete et. al.6 e ulteriormente sviluppato da Jiang et. al.8 ed è stato utilizzato come mezzo per introdurre plasmidi virali e non virali nel cristallino dei pulcini embrionali 1,9,10,11,12,13. Nel complesso, il lavoro precedente dimostra il potenziale dell'utilizzo di questa metodologia per studiare lo sviluppo del cristallino, la differenziazione, la comunicazione cellulare e la progressione della malattia, e per la scoperta e il test di bersagli terapeutici per condizioni patologiche del cristallino come la cataratta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td>For removing cellular debris from media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Culture Dish</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>50-202-030</td>
			<td>For using during microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-100-676</td>
			<td>Spinning down solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constructs</td>
			<td>GENEWIZ</td>
			<td>-</td>
			<td>For generation of constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-4TZ-144A</td>
			<td>Visualization of lens for microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>Generation of primers: 
			 
			Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1&#8211;97 and 149&#8211;400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC 
			 
			ILs of Cx43 (residues 98&#8211;150) and Cx46 (residues 98&#8211;166) were&#160; obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively 
			 
			Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC 
			 
			ILs of Cx50 (residues 98&#8211;148) or Cx46 (residues 98&#8211;166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td>Microinjection Pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>LED-50WY</td>
			<td>Lighting for visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Holder</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Incubator</td>
			<td>GQF Manufacturing Company Inc.</td>
			<td>1502</td>
			<td>For incubation of fertilized eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>F99-10</td>
			<td>For visualization of viral stock injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td>
			<td>Texas A&#38;M University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-095-003</td>
			<td>For anti-FLAG&#160; 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td>For moving things around and isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td>Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000001</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual vertical micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td>To obtain glass micropipette of the correct size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-682-004</td>
			<td>Dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td>For imaging staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>03-448-254</td>
			<td>Placing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-Injector</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PLI-100</td>
			<td>For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-chick AQP0</td>
			<td>Self generated</td>
			<td>-</td>
			<td>Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-FLAG antibody</td>
			<td>Rockland Immunichemicals</td>
			<td>600-401-383</td>
			<td>For staining FLAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-295-003</td>
			<td>For anti-AQP0&#160; 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge clamping pad</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BX10</td>
			<td>For storage of glass micropipette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of recombinant rcas(a) retrovirus into embryonic chicken lens

Il pollo embrionale (Gallus domesticus) è un modello animale ben consolidato per lo studio dello sviluppo e della fisiologia del cristallino, dato il suo alto grado di somiglianza con il cristallino umano. RCAS(A) è un retrovirus di pollo competente per la replicazione che infetta le cellule in divisione, che funge da potente strumento per studiare l'espressione e la funzione in situ di proteine wild-type e mutanti durante lo sviluppo del cristallino mediante microiniezione nel lume vuoto della vescicola del cristallino nelle prime fasi di sviluppo, limitando la sua azione alle cellule del cristallino proliferanti circostanti. Rispetto ad altri approcci, come i modelli transgenici e le colture ex vivo , l'uso di un retrovirus aviario RCAS(A) competente per la replicazione fornisce un sistema altamente efficace, rapido e personalizzabile per esprimere proteine esogene negli embrioni di pulcino. In particolare, il trasferimento genico mirato può essere confinato alle cellule proliferative della fibra del cristallino senza la necessità di promotori tessuto-specifici. In questo articolo, forniremo una breve panoramica dei passaggi necessari per la preparazione del retrovirus ricombinante RCAS(A), forniremo una panoramica dettagliata e completa della procedura di microiniezione e forniremo i risultati di esempio della tecnica.

The goal of this protocol is to describe the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) (replication-competent avian sarcoma/leukosis retrovirus A). Effective retroviral delivery in an embryonic chicken lens has been demonstrated to be a promising tool for the in vivo study of the molecular mechanism and structure-function of lens proteins in normal lens physiology, pathological conditions, and development. Moreover, this experimental model could be used for the identification of therapeutic targets and drug screening for conditions such as human congenital cataracts. In all, this protocol aims to lay out the necessary steps for the development of a customizable platform for the study of lens proteins.
Embryonic chicks (Gallus domesticus), owing to their similarity in lens structure and function with the human lens, are a well-established animal model for the study of lens development and physiology1,2,3,4. The use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus has been regarded as a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Notably, it has a unique ability to confine the target gene transfer to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters, using the unique embryonic development time frame in which the presence of empty lens lumen permits in situ RCAS(A) microinjection into the restricted site for the expression of exogenous proteins within proliferative lens fiber cells5,6,7,8.
The chick embryo microinjection procedure, described in-depth here, is based originally partially on the work of Fekete et. al.6 and further developed by Jiang et. al.8 and has been utilized as a means of introducing both viral and nonviral plasmids into the lens of embryonic chicks1,9,10,11,12,13. Overall, the previous work demonstrates the potential of utilizing this methodology to study lens development, differentiation, cellular communication, and disease progression, and for the discovery and testing of therapeutic targets for lens pathological conditions such as cataracts.

Autore in primo piano: Studio dello sviluppo e della funzione del cristallino attraverso la microiniezione di retrovirus RCAS(A) nel cristallino embrionale di pollo 

Microiniezione di retrovirus RCAS(A) ricombinante nel cristallino embrionale di pollo

The presented methodology of embryonic chicken lens microinjection of a RCAS retrovirus is meant as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the RCAS replication-competent avian retrovirus provides a highly-effective, rapid, and customizable system for expressing exogenous proteins in chick embryos. Targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for promoters.There is prominent potential for utilizing this methodology to study lens development, differentiation, cellular communication, and disease progression, and for the discovery and testing of therapeutic targets for lens pathological conditions such as cataracts.

Dopo la determinazione di una specifica proteina bersaglio e l'identificazione della sequenza genica associata, l'approccio sperimentale complessivo prevede il clonaggio della sequenza genica in un vettore retrovirale RCAS(A) mediante il clonaggio iniziale in un vettore adattatore, seguito da un vettore virale. In secondo luogo, le particelle virali ad alto titolo vengono preparate utilizzando cellule di imballaggio per raccogliere e concentrare i virioni. Questi primi due passi principali sono stati ampiamente descritti...

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Questo documento di protocollo descrive la metodologia della microiniezione embrionale di lenti di pollo di un retrovirus RCAS(A) come strumento per studiare la funzione in situ e l'espressione delle proteine durante lo sviluppo della lente.

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...

La metodologia presentata di microiniezione embrionale con lente di pollo di un retrovirus RCAS è intesa come uno strumento per studiare la funzione in situ e l'espressione delle proteine durante lo sviluppo della lente. Rispetto ad altri approcci, come i modelli transgenici e le colture ex vivo, il retrovirus aviario competente per la replicazione RCAS fornisce un sistema altamente efficace, rapido e personalizzabile per l'espressione di proteine esogene negli embrioni di pulcino. Il trasferimento genico mirato può essere confinato alle cellule proliferative della fibra del cristallino senza la necessità di promotori.Esiste un notevole potenziale per l'utilizzo di questa metodologia per studiare lo sviluppo del cristallino, la differenziazione, la comunicazione cellulare e la progressione della malattia, e per la scoperta e il test di bersagli terapeutici per condizioni patologiche del cristallino come la cataratta.

microinjection-recombinant-rcasa-retrovirus-into-embryonic-chicken

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

700 Views.  University of Texas Health Science Center, San Antonio. La metodologia presentata di microiniezione embrionale con lente di pollo di un retrovirus RCAS è intesa come uno strumento per studiare la funzione in situ e l'espressione delle proteine durante lo sviluppo della lente. Rispetto ad altri approcci, come i modelli transgenici e le colture ex vivo, il retrovirus aviario competente per la replicazione RCAS fornisce un sistema altamente efficace, rapido e personalizzabile per l'espressione di proteine esogene negli embrioni di pulcino. Il trasfe...

Video: Autore in primo piano: Studio dello sviluppo e della funzione del cristallino attraverso la microiniezione di retrovirus RCAS(A) nel cristallino embrionale di pollo 

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of similarity with the human lens. RCAS(A) is a replication-competent chicken retrovirus that infects dividing cells, which serves as a powerful tool to study the in situ expression and function of wild-type and mutant proteins during lens development by microinjection into the empty lumen of lens vesicle at early developmental stages, restricting its action to surrounding proliferating lens cells. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus provides a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Specifically, targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters. In this article, we will briefly overview the steps needed for recombinant retrovirus RCAS(A) preparation, provide a detailed, comprehensive overview of the microinjection procedure, and provide sample results of the technique.

This protocol paper describes the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) retrovirus as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development.

Ricerca

Biologia

Preparation of Chicken Lens for Microinjection of an RCAS(A) Retrovirus

To begin, attach the borosilicate glass capillary to the rubber cushioned clips in the manual vertical micropipette puller. Set the heat temperature of the micropipette puller to 950 degrees Celsius and perform pre-pulling to obtain a thinner and softer glass capillary. Then set the heat temperature to 790 degrees Celsius and perform a secondary pulling to produce final micropipettes.Using a micropipette grinder, carefully sharpen the tip opening to an outer diameter of 11 micrometers. Then place the micropipettes in a sponge clamping pad inside of a glass jar. Incubate the fertilized chicken eggs until development stage 18 in a 37 degree Celsius humidified rocking incubator.Wipe down the working area thoroughly with 70%ethanol. After development, remove the eggs from the incubator. Spray the eggs with 70%ethanol and allow them to air dry.Then place the egg on an egg holder with the larger end facing upwards. Using a pair of sharp toothed forceps, carefully tap on the larger end of the eggshell to create a two centimeter diameter hole. Then remove the fragments of the egg shell.Place the egg on a dissecting microscope stage and locate the embryo. Next, use the fine dissecting forceps and scissors to cut off the amniotic membrane covering the top of the embryo. Then place a 60 millimeter Petri dish over the opening of the egg.

Preparazione della lente di pollo per la microiniezione di un retrovirus RCAS(A)

Microinjection of an RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens for Expressing Exogenous Proteins 

To begin, thaw the RCAS(A)retrovirus stock on ice. To avoid clogging the micropipette, centrifuge the solution at 10, 000 G for 10 seconds at four degrees Celsius and transfer the supernatant into a new tube while keeping the solutions on ice. Place a stretched laboratory parafilm on a 35 by 10 millimeter cell culture dish and add one microliter of sterile PBS to the parafilm.Connect a prepared glass micropipette to an automatic Pico injector. Press the fill mode to fill the PBS into a micropipette and then press the inject mode to test the allocated one microliter of liquid. Place a second piece of stretched laboratory parafilm on a new cell culture dish and add one microliter of fast green stained viral stock to the film.Lower the tip of the micropipette into the viral stock, and press the fill mode to fill the micropipette with one microliter of viral stock. Under a dissecting microscope, lower the filled micropipette connected to an automatic injector into the target region of the chicken embryo lens. Then adjust the light source to provide a clear view of the lens vesicle.After ensuring the micropipette is within the correct location inside the lens lumen, inject five to 40 nanoliters of the viral stock. After injection, wait 45 seconds before gently removing the micropipette. Next, check the successful microinjection by examining the fast green dye in the empty lumen of the lens without an leakage.Following examination, seal the eggshell opening with scotch tape and place the eggs in a 37 degree Celsius humidified static incubator. This study demonstrates the histological evaluation of the chimeric connexon 50 and 43 loops through immunofluorescence. Using Anti-Flag labeling, exogenous connexons were distinguished from endogenous ones.The study also evaluates the interaction between the intracellular loop domain of connexon 50 and Aquaporin zero.