Questo saggio di fagocitosi in vivo consente ai ricercatori di effettuare schermi genetici e studi di associazione a livello genomico per identificare nuovi geni che regolano la fagocitosi nelle cellule del sangue adulte. Questo esperimento è quantitativo, facile da eseguire e può essere applicato allo screening di animali vivi per fattori ospiti che influenzano il riconoscimento, l'assorbimento e la clearance degli agenti patogeni. Dopo aver tirato capillari in vetro a parete sottile con un estrattore ad ago, utilizzare un micrometro per tenere l'ago al microscopio e utilizzare le pinzette in acciaio inossidabile a punto fine al numero cinque per rompere la punta a un diametro della punta di 100 micrometri.
Per misurare il volume di liquido che verrà iniettato in ogni mosca, caricare un ago capillare con colorazione sterile del 5% degli alimenti in PBS ed espellere il liquido su una goccia di olio minerale su un micrometro a stadio di 0,01 millimetri. Distribuire 10 microlitri da 1,6 milligrammi per particelle millilitre su un piccolo quadrato di Parafilm e tirare il liquido nell'ago. Montare l'ago nell'ugello dell'iniettore e allineare le mosche anestetizzate lungo la loro area designata sul fly pad, lato ventrale verso l'alto, con le teste orientate verso la parte anteriore del pad.
Posizionare le fiale nelle aree corrispondenti sul banco e iniettare le mosche nell'angolo superiore dell'addome con cinque pompe di liquido da 100 millisecondi per fornire circa 10 nanolitri di particelle in totale. Trasferire ogni mosca nella fiala appropriata mentre viene iniettata, notando il tempo sul flaconcino. Successivamente, caricare un nuovo ago con la soluzione 0.4%Trypan Blue e impostare l'iniettore pneumatico su gated, per consentire un flusso costante di aria per spingere il liquido fuori dall'ago.
30 minuti dopo l'iniezione iniziale, iniettare ogni addome di mosca con Trypan Blue fino a quando gli addome sono pieni e distesi. Montare le mosche su vetrini al microscopio con nastro elettrico, lato ventrale verso il basso, spingendo le ali sul lato della mosca per fissarle al nastro. Quindi, spingere delicatamente la testa nel nastro per assicurarsi che la mosca non si muova.
Subito dopo che tutte le mosche sono state fissate, immagini gli insetti, uno alla volta, con un ingrandimento 25 o 32 volte superiore su un microscopio a fluorescenza invertito collegato a una fotocamera digitale e a un computer, concentrandosi sul vaso dorsale di ogni mosca utilizzando il software del computer per la fotocamera digitale. Quindi, registrare il tempo di esposizione e l'ingrandimento tra gli esperimenti. Per quantificare la fluorescenza, aprire un programma di analisi dell'imaging appropriato e aprire un'immagine.
Per misurare l'intensità di fluorescenza del vaso dorsale, disegnare un poligono attorno al vaso dorsale e selezionare Misura per registrare l'intensità della fluorescenza all'interno del poligono. Per determinare l'intensità della fluorescenza di fondo, copiare il primo poligono e spostarlo in un'area adiacente al vaso dorsale di ogni mosca. Quindi, selezionate Misura (Measure) e registrate l'intensità di fluorescenza dell'area di sfondo.
Per normalizzare la fluorescenza del vaso dorsale per la fluorescenza di fondo, dopo aver misurato le intensità di fluorescenza del resto delle mosche, dividere la fluorescenza del vaso dorsale per la fluorescenza di fondo e calcolare l'intensità media di fluorescenza del vaso dorsale normalizzata di tutte le mosche in un unico ceppo. Dopo essere stati montati sul lato ventrale verso il basso su un pezzo di nastro elettrico, i primi due segmenti dell'addome, dove si trova il vaso dorsale, sono chiaramente visibili. Le principali fonti di errore sperimentale si verificano nelle fasi di iniezione e imaging della procedura.
L'uso dello stesso ago per iniettare più mosche può causare l'intasarsi di tessuto di mosca o particelle. Mosche che non ricevono abbastanza fluorescenza Trypan Blue brillantemente in tutto il loro addome, il che può ridurre il rapporto tra il vaso dorsale e la fluorescenza di fondo, diminuendo così il vero rapporto di intensità della fluorescenza dell'animale. Le mosche dovrebbero essere fotografate mentre sono immobilizzate dall'anidride carbonica, poiché le mosche in movimento attivo producono immagini sfocate che non possono essere quantificate.
Una linea mutante della collezione Zuker di mosche trattate con etile metanosulfonato non è in grado di flegocitosi batteri gram-negativi e gram-positivi e non mostra quasi nessuna fluorescenza del vaso dorsale nel saggio di fagocitosi in vivo, accoppiata al ceppo di Zuker di fondo isogenico e a un altro comune ceppo di controllo di laboratorio. Tieni traccia del tempo e dell'ordine in cui le mosche vengono iniettate per garantire che le mosche si trovano in fasi comparabili di riconoscimento e assorbimento degli agenti patogeni quando vengono immagini. I meccanismi molecolari alla base dei difetti fagocitici possono essere determinati studiando singoli emociti con microscopia confocale o dopo lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o mediante isolamento magnetico delle perline di emociti adulti.
