Il nostro protocollo fornisce un approccio efficace e ripetibile per valutare e quantificare gli eventi fagocitici negli emociti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo quantificare gli eventi fagocitici all'interno dei singoli emociti che ci consente di rilevare variazioni nei processi fagocitici tra i genotipi nelle singole mosche. Eseguire le dissezioni può essere impegnativo, quindi quando si esegue questa tecnica per la prima volta, praticare le dissezioni il più possibile prima di eseguire l'intera procedura.
Inizia preparando aghi di vetro per iniezione. Riempire una siringa di un millimetro con olio minerale e attaccare l'ago ipodermico calibro 30 fornito con il nano-iniettore. Inserire l'ago calibro 30 nell'estremità smussata di un ago capillare tirato e riempirlo con olio minerale.
Rimuovere lentamente l'ago calibro 30 assicurandosi che non si formino bolle d'aria. Rimuovere la pinza e posizionare l'O-ring sigillato con l'indentazione rivolta verso l'alto. Posizionare l'O-ring più grande sullo stantuffo metallico, quindi riattaccare la pinza senza stringere.
Inserire lo stantuffo metallico nell'estremità smussata dell'ago di vetro riempito d'olio e spingerlo delicatamente verso il basso inserendolo nell'O-ring più grande. Quindi stringere la pinza fino a quando non è sicuro. Dopo aver riempito l'ago con particelle sensibili al fluoro o al pH, iniettare le mosche nella piastra sternopleurale del torace.
L'iniezione ha successo se il colorante verde sta andando al volo. Posizionare le mosche iniettate in una nuova fiala alimentare notando il momento in cui la prima e l'ultima mosca sono state iniettate. Posare la fiala su un lato fino a quando tutte le mosche non si sono riprese per evitare che si blocchino nel cibo.
Orientare il lato ventrale della mosca verso l'alto sotto uno stereomicroscopio sezionato. Quindi inserire una spilla insetto nel torace e un'altra attraverso l'estremità più posteriore dell'addome vicino ai genitali. Una volta che tutte le mosche sono state appuntate, utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere abbastanza mezzi di dissezione per coprire le mosche.
Rimuovere la testa con le forbici della cuticola e fare un'incisione orizzontale direttamente sopra il perno posteriore nell'addome, quindi un'altra all'estremità più anteriore dell'addome. Fai un'incisione verticale che collega le due incisioni orizzontali che apriranno la cavità addominale. Utilizzare le forcelle per rimuovere gli organi e i tessuti interni, assicurandosi di evitare il vaso dorsale.
Se necessario, utilizzare perni aggiuntivi per fissare le estremità tagliate della cuticola. Quindi rimuovere il torace con le forbici della cuticola. Scartare il supporto di dissezione e sostituirlo con un millilitro del 4%PFA, proteggendo il più possibile le dissezioni dalla luce.
Fissare le dissezioni per 15 minuti a temperatura ambiente mentre si dondola a 20 giri/min. Quindi rimuovere il fissatore e aggiungere un millilitro di 1X PBST. Se lo si desidera, macchiare le dissezioni con anticorpi.
Dopo aver montato le cuticole su uno scivolo al microscopio, utilizzare le forcep per orientarle sul lato ventrale verso l'alto e assicurarsi che il vaso dorsale sia visibile. Le mosche giovani e invecchiate sono state valutate per la capacità specifica dell'età di effettuare la fagocitosi mediante imaging fluorescente di emociti lungo il vaso dorsale. Un anticorpo contro la pericardina è stato usato per garantire che fossero contate solo le cellule lungo il vaso dorsale.
Poiché le particelle E.coli etichettate fluorescentmente hanno una lunghezza di un micrometro e gli emociti hanno un diametro di 10 micrometri, sono stati contati solo eventi fluorescenti all'interno di un diametro di 10 micrometri centrato su un nucleo positivo a DAPI. Il software ImageJ è stato quindi utilizzato per quantificare gli eventi. Quando si tenta questa procedura, è importante visualizzare che la mosca è stata effettivamente iniettata e ricordare che la tempistica è fondamentale.
Completare le iniezioni e le dissezioni in modo tempestivo aiuterà a ridurre al minimo l'errore sperimentale e le possibili variazioni del tasso fagocitico. Questa tecnica consentirà ai ricercatori di esplorare una varietà di argomenti di ricerca tra cui domande riguardanti l'immunità cellulare, diverse popolazioni di cellule del sangue o la fagocitosi distintiva dalla produzione amp durante una risposta immunitaria di successo.
