Questo protocollo può aiutare lo scienziato interessato alla microscopia non lineare a comprendere i componenti chiave, l'impostazione e la procedura di allineamento di un microscopio basato sullo scattering Raman stimolato. I principali vantaggi della microscopia SRS sono le sue capacità di eseguire immagini senza etichette basate sul contrasto vibrazionale e di acquisire un'immagine in pochi secondi. La microscopia SRS ha portato l'imaging senza etichette a nuovi livelli, in particolare studi su strutture biologiche complesse come i lipidi, che sono fondamentali per le cellule e l'architettura cellulare.
Il segnale SRS viene rilevato come un piccolo cambiamento nell'intensità del fascio della sonda e può essere danneggiato dal rumore. Pertanto, un segnale accurato è fondamentale. Per iniziare, allineare l'OPO e i raggi laser titanio-zaffiro in modo che entrambi raggiungano il microscopio.
Quindi, posizionare i rivelatori del sensore di posizione del raggio laser in due posizioni tra lo specchio dicroico uno e lo specchio sei. La prima posizione si trova vicino allo specchio dicroico uno e la seconda è vicina allo specchio sei. Per ogni posizione, utilizzare i sensori per rilevare le coordinate X e Y del fascio OPO.
È importante sottolineare che le coordinate X e Y del raggio laser titanio-zaffiro sono dello stesso OPO in entrambe le posizioni dei rivelatori del sensore. Se, in alcune posizioni, le coordinate non coincidono, sintonizzate l'inclinazione dello specchio adiacente per compensare. Seguire questa stessa procedura per allineare le posizioni del fascio di titanio-zaffiro rispetto all'OPO per il percorso tra i sei e i sette dello specchio.
Installare uno specchio aggiuntivo su un supporto flip-flop tra lo specchio sei e sette e capovolgere il supporto dello specchio per dirigere la trave nell'autocorrelatore. Accensione del controller autocorrelatore, avviare l'applicazione software sul computer che la controlla e impostare la vite di regolazione della distanza del fascio dell'autocorrelatore sulla sua posizione normale a 8,35 millimetri. Quindi, arrestare il fascio di zaffiro di titanio e rilasciare e proiettare il fascio OPO dallo specchio aggiuntivo allo specchio di ingresso dell'autocorrelatore.
Prova a regolare lo specchio di ingresso per massimizzare il segnale di impulso laser come mostrato qui. Quindi, arrestare il fascio OPO e rilasciare e proiettare la trave in titanio zaffiro dallo specchio montato in infradito allo specchio di ingresso e all'autocorrelatore. Ripetere la regolazione ottimale del fascio fino a ottenere il segnale di autocorrelatore, mostrato qui.
Ora, impostare la vite di regolazione della distanza del fascio sulla posizione trasversale a 7,30 millimetri. Rilasciare entrambe le travi e scansionare la linea ritardata per sovrapporre le due travi. Ottenere il segnale cross-correlatore risultante, come mostrato qui.
Quindi, capovolgere lo specchio montato sulle infradito in modo che le travi possano raggiungere lo specchio sette e la testa di scansione del microscopio. Rimuovere il condensatore e utilizzare il pulsante di fuga per ritrarre temporaneamente l'obiettivo soggettivo 60x. Quindi ruotare il nasello per spostare la lente soggettiva 60x dal percorso ottico.
Quindi, montare il rilevatore nella parte superiore del microscopio utilizzando il supporto meccanico esterno. Collegare l'uscita del rilevatore tramite un filtro passa basso da 50 Ohm a un oscilloscopio. Ora, accendi il processore che controlla la testa dello scanner e proietta il fascio OPO nella testa dello scanner del microscopio.
Monitorare il segnale OPO e massimizzare la potenza misurata dal rilevatore utilizzando un traduttore XY. Quindi, passare il raggio dal laser OPO al laser titanium-zaffiro e verificare che si ottiene anche un segnale per il laser titanium-zaffiro. Ciò indica che entrambe le travi sono ben allineate.
Finalizzare l'allineamento del fascio ruotando indietro il nasello per introdurre il 60x soggettivo. Quindi, utilizzare il pulsante di rifocalizzare sul microscopio per recuperare la messa a fuoco finalizzata sull'obiettivo del microscopio 60x. Infine, posizionare l'obiettivo, con un ingrandimento di 40x, al posto del condensatore senza toccare o disturbare il campione.
Impostare la potenza dei laser Titanium-sapphire e OPO misurati prima del microscopio su 30 milliwatt per entrambi i raggi. Quindi, impostare la lunghezza d'onda del laser OPO su un valore diverso, rispetto al precedente, in modo che la pompa e la sonda non siano in risonanza con la frequenza vibrazionale delle perline. Quindi, rilasciare entrambe le travi, in modo che entrino nel microscopio.
Eseguire il traduttore computerizzato della linea di ritardo di scansione e registrare l'intensità misurata utilizzando l'amplificatore lock-in per ogni posizione della linea di ritardo. Attendere il completamento della scansione della riga di ritardo. Ora, impostate la lunghezza d'onda dell'OPO su 1076 nanometri, in modo che la pompa e la sonda siano in risonanza con la frequenza vibrazionale delle perline.
Eseguire il traduttore computerizzato della riga di ritardo della scansione e attendere il completamento della scansione della riga di ritardo. Infine, impostare la posizione del fascio di sovrapposizione ottenuta e la linea di ritardo per la successiva acquisizione di immagini di scattering Raman stimolate. Per ottimizzare la sincronizzazione spaziale delle travi, iniziare arrestando il fascio di titanio-zaffiro e riducendo la potenza OPO a otto milliwatt.
Quindi, collegare la lettura del rilevatore alla scheda di acquisizione dati. Eseguire il programma di acquisizione dati insieme alla console di scansione del microscopio. Al termine, salva il file ed elabora i dati per ottenere un'immagine come quella mostrata qui.
Quindi, arrestare il fascio OPO e ridurre la potenza dello zaffiro di titanio a 2,5-4,5 milliwatt. Collegare il rilevatore con l'amplificatore lock-in e le sue letture con la scheda di acquisizione dati. Quindi, eseguire nuovamente il programma di acquisizione dati insieme alla console di scansione del microscopio.
Al termine, salva il file ed elabora i dati per ottenere un'immagine come quella mostrata qui. Introdurre una pila di filtri tra l'obiettivo 40x e il fotodiodo per rimuovere gli impulsi della pompa e acquisire solo il segnale di stoke. Quindi, impostare il segnale della pompa su 810 nanometri con una potenza focalizzata di otto milliwatt.
Impostare il segnale della sonda su 1076 nanometri con la stessa potenza focalizzata di otto milliwatt per studiare un tipico legame carbonio-idrogeno del polistirolo con uno spostamento raman di 3054 centimetri inversi. Collegare il rilevatore con l'amplificatore lock-in e la lettura dell'amplificatore lock-in alla scheda di acquisizione dati. Infine, impostare il formato pixel e il tempo di acquisizione nel programma del microscopio ed eseguito e il sistema di acquisizione dati, salvando il file della matrice una volta completato.
Qui viene visualizzata una misurazione di esempio da un singolo punto del campione. Quando il fascio non è sovrapposto nel tempo o nello spazio, il risultato ottenuto è fuori risonanza, dove l'ampiezza del segnale, misurata da un amplificatore lock-in, è zero. La fase di questo segnale, tuttavia, salta tra valori negativi e positivi.
Se le travi sono sovrapposte nello spazio, il segnale aumenta e raggiunge il suo massimo quando le travi sono perfettamente sovrapposte nel tempo, mentre la fase inizia a raggiungere un valore fisso durante il periodo in cui le travi sono sovrapposte. In un'immagine di trasmissione, viene utilizzato un singolo fascio e l'intensità del fascio trasmesso dal campione viene misurata da un fotodiodo. A sinistra, l'immagine di trasmissione è stata ottenuta utilizzando OPO, mentre a destra, l'immagine di trasmissione è stata ottenuta utilizzando titanio-zaffiro.
Un tipico esempio di immagine SRS è mostrato qui, in cui sono riportate immagini senza etichette di perline di polistirolo con diametri di tre micrometri. Al fine di ottenere un'immagine di alta qualità, basata sulla microscopia SRS, l'allineamento di un microscopio è fondamentale. Pertanto, tutti i gradini indicati nel protocollo devono essere eseguiti con attenzione.
