Vorremmo ringraziare Iwan Schie e Sebastian Wachsmann-Hogiu per il loro contributo nello sviluppo della DR-CARS tecnica. Settimane Tyler riconosce il sostegno dal Programma Scholar Lawrence Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser è grata per il supporto della American Heart Association mediante la concessione in Aid programma. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento della National Science Foundation. Il Centro per Biofotonica, un NSF Scienza e Tecnologia Center, è gestito dalla University of California, Davis, ai sensi del Contratto Cooperativa PHY n. 0120999. Il supporto è riconosciuto anche dal Centro di Scienze Cliniche UCD traslazionale con il numero concedere UL1 RR024146 dal Centro Risorse Nazionale per la Ricerca (NCRR).

1. Generazione di auto e DR-CARS Segnali Al fine di generare CARS e DR-CARS segnali contemporaneamente, tre fonti breve sintonizzabile e sincronizzata laser pulsati sono obbligatori. <ol><li> Per ottenere tre impulsi sincronizzati si inizia con un singolo 10 W laser (PicoTrain, HighQ laser, Inc.). Questo laser ha una lunghezza d&#39;onda fissa di 1064 nm, una lunghezza di impulso fisso di 7 ps, e un tasso di ripetizione fissa di 76 MHz. </li><li> Utilizzando una serie di semionda lastre e cubetti di polarizzazione divisore di fascio il fascio viene diviso in tre parti. Un semionda piatto abbinato ad un cubo beam splitter polarizzante ci permette di regolare la quantità di energia in ogni componente del fascio senza cambiare la sua direzione. Tipicamente, due fasci sono adeguati per ~ 4,5 W ciascuno, e il terzo fascio contiene il restante 1 W. </li><li> I due fasci ad alta potenza sono poi diretti in due oscillatori indipendenti parametrici ottici (OPO, la Avante, APE GmbH, Berlino, Germania). OPO uso di generazione di frequenza differenza di convertire un fotone di energia superiore in due fotoni di energia inferiore con diverse lunghezze d&#39;onda. Controllando la temperatura del cristallo utilizzato per ottenere questo effetto, le lunghezze d&#39;onda dei fotoni risultante può essere controllato di 0,1 nm. Per frequenza raddoppio questi segnali, un laser con lunghezza d&#39;onda fissa di 1064 nm può essere trasformato in un raggio laser che può essere sintonizzato ovunque tra 780 nm a 910 nm. Pompando due distinti OPO con la stessa fonte di 1064 nm, si ottengono due sorgenti laser sintonizzabile in modo indipendente che vengono automaticamente sincronizzati con i nostri laser della pompa originale. </li><li> La terza (potenza più bassa) dal fascio laser 1064 nm pompa è diretto in tutto il OPO è da una combinazione di specchi dicroici in modo che tutti e tre i fasci (2 da OPOS, 1 dal laser di pompa) possono essere ricombinati in seguito. Al fine di produrre in modo efficiente coerente fotoni segnale Raman gli impulsi ricombinati devono essere sovrapposti sia temporalmente e spazialmente. OPO perché contengono cavità anello, permettendo ad ogni impulso laser di passare attraverso il cristallo più volte, le travi inviati attraverso i viaggi del OPO è una distanza in più con conseguente notevole ritardo rispetto al fascio di pompa originale. Questa distanza deve essere compensata con il terzo fascio con l&#39;introduzione di specchi in più che forza questo raggio per percorrere la stessa distanza come gli altri due prima di essere ricombinati con specchi dicroici. </li><li> Al fine di fornire la regolazione fine della lunghezza del percorso di ciascun fascio viaggia fasi ritardo regolabile, utilizzando retroriflettori prisma, vengono introdotti in ogni percorso del raggio. </li><li> Un&#39;altra serie di semionda lastre e cubetti di polarizzazione del fascio splitter vengono aggiunti a ogni raggio per permetterci di regolare la potenza di ogni fascio in modo indipendente senza influenzare l&#39;ingresso del OPO è. </li><li> Specchi dicroici sono utilizzate per combinare la prima delle due travi OPO e poi con il fascio di 1064 nm. Si deve prestare attenzione per assicurare che le travi sono esattamente sovrapposti (cioè sono allineati e hanno divergenza simili). Questo può essere verificato confrontando la sovrapposizione delle travi vicino a (pochi centimetri) e lontano da (~ 1 m) lo specchio dicroico. </li><li> Il vantaggio di utilizzare laser pulsati è che ogni impulso può avere un alta energia di picco al campione, consentendo per la generazione efficiente di segnali Raman coerente, pur mantenendo una bassa intensità media. Una intensità media alta può danneggiare il campione. Pertanto al fine di controllare ulteriormente l&#39;intensità media, senza sacrificare l&#39;energia di picco, le tre travi combinato vengono inviati attraverso un elettro-ottici modulatore (cella Pockel, il ConOptics) funziona come un selettore di impulsi, che ci permette di regolare la frequenza di ripetizione degli impulsi che arrivare al nostro campione e quindi l&#39;intensità media. </li><li> I raggi laser vengono poi combinati insieme in un microscopio rovesciato con un obiettivo alto NA. L&#39;obiettivo è tipicamente un acqua 60 X lenti dell&#39;obiettivo con una apertura numerica (NA) di 1,2, che è stato corretto per l&#39;aberrazione cromatica tutta la gamma di sintonizzabilità di OPO è nostra e il 1064 fascio nm. La stretta di messa a fuoco generato dalla lente dell&#39;obiettivo alta NA consente la generazione più efficiente di segnali coerenti Raman sulla scala micron. </li><li> Le travi combinati sono espanse in modo da riempire troppo il retro-porto di l&#39;obiettivo microscopio. Da un eccessivo riempimento del retro dell&#39;obiettivo microscopio possiamo ottenere le migliori condizioni di messa a fuoco e quindi la migliore risoluzione spaziale nel nostro sistema microscopio. </li><li> La lente obiettivo del nostro microscopio è montato su un palco XYZ piezo che ci permette di ottenere immagini da raster-scanning le travi in ​​tutto il campione, simile a quello commerciale fascio-microscopi a scansione confocale. </li></ol> 2. L&#39;uso di tre laser a impulsi brevi L&#39;utilizzo di tre risultati a breve impulsi laser nella produzione di diversi segnali CARS, dai vari combinations di due laser, così come 3-Color CARS e DR-FWM segnali dalla combinazione di tutti e tre i laser. <ol><li> Le lunghezze d&#39;onda dei segnali può mentire spettralmente vicini gli uni agli altri. Quando i segnali sono vicini tra loro può essere difficile separarli per l&#39;analisi utilizzando filtri passa-banda fisse lunghezza d&#39;onda e specchi dicroici. Per questo motivo i nostri segnali sono passati in uno spettrometro di immagini (SpectraPro 2300i, Acton Ricerca) che serve anche come un monocromatore efficiente per separare spazialmente segnali a diverse lunghezze d&#39;onda. </li><li> Uno specchio a comando elettronico all&#39;interno capovolgere lo spettrometro in posizione abbassata invia il segnale ad un retro-illuminato profondo esaurimento charge-coupled device (CCD) della fotocamera che fornisce informazioni spettroscopiche su tutta la gamma intero segnale e ci permette di identificare e ottimizzare le varie coerente segnali Raman. </li><li> Per selezionare il segnale con il quale vogliamo immagine che semplicemente ruotare la griglia all&#39;interno dello spettrometro, utilizzando il forniti dal produttore controllo e acquisizione dati software (WinSpec, Princeton Instruments), al centro il picco di interesse sulla fotocamera CCD e quindi modificare il posizione dello specchio flip per reindirizzare il segnale ad una porta seconda uscita alla quale un singolo fotone valanga conteggio fotodiodo (APD) è stato allegato. </li><li> La lente obiettivo è quindi raster acquisiti e dei segnali registrati sul APD sono usati per generare un&#39;immagine visualizzando il fotone count-rate per ogni pixel tramite il software di acquisizione dati (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlino, Germania). </li><li> Ripetiamo questa procedura di imaging per ogni segnale coerente desiderato Raman che ci permette di confrontare i segnali durante la post-elaborazione. </li></ol> 3. Preparazione del campione Al fine di ottenere immagini chiare e riproducibile una certa cura deve essere presa nella preparazione del campione. <ol><li> I campioni sono in genere preparati su ~ 150 micron di spessore lamelle di vetro. Queste coprioggetto sono abbastanza sottile per consentire l&#39;imaging ad alta risoluzione con il 1.2 NA obiettivi che sono tipicamente utilizzati. </li><li> Intrappolamento ottico di oggetti dielettrici può verificarsi quando la luce laser viene diffratta attraverso piccoli oggetti trasparenti. L&#39;utilizzo di ben focalizzato, elevata potenza di picco, a breve raggi laser pulsato quindi possibile trascinare piccole cellule o batteri lungo, con conseguente immagini sfocate o macchiate. Per evitare ciò, può essere necessario immobilizzare il campione sulla superficie del vetrino di vetro in primo luogo applicando un sottile strato di poli-L-lisina da spin-coating. </li><li> Per le cellule in coltura di vetro piatti cultura fondo può essere utilizzato per l&#39;imaging che permettono, senza la necessità di staccare le cellule dal loro piatti cultura la crescita delle cellule. </li><li> Per la dimostrazione di questo contributo abbiamo prima un deposito fissati in formaldeide e C. elegans verme nematode su un foglietto copertura in vetro. </li><li> Quindi aggiungere una goccia 20 ml di soluzione glucosata al 5 M deuterati al worm. La soluzione di glucosio deuterati offre una firma unica e forte background Raman. </li></ol> 4. Esempio di Analisi Al fine di tenere adeguatamente sfruttare l&#39;effetto valorizzazione doppiamente risonante gli spettri Raman di entrambi Raman-risonante sostanze devono essere noti. <ol><li> Una volta che il campione è preparato sul vetrino che viene analizzato con un microscopio confocale Raman per ottenere le relative spettro Raman spontaneo ed identificare i picchi adeguati. </li><li> Per eseguire DR-CARS ci identifichiamo i luoghi spettrali della modalità tratto CH, tipicamente associate con i lipidi, e la modalità tratto CD, associato al glucosio deuterati, da 2845 centimetri -1 e 2121 centimetri -1 rispettivamente. </li><li> Coerente scattering Raman si ottiene quando la differenza di frequenza tra due laser corrisponde alla frequenza di una vibrazione molecolare. Messa a punto da uno OPO a 817 nm sarà sondare la centimetro 2845 -1 modalità CH quando combinato con il raggio laser 1064 nm e dalla messa a punto del OPO altro a 868 nm sarà sondare la centimetro 2121 -1 picco quando combinato con il fascio di 1064 nm . </li><li> Da raster-scanning il campione sul microscopio CARS ora possiamo osservare tre segnali Raman coerente di interesse. Un segnale AUTO sondare l&#39;allungamento CH vibrazione, un segnale AUTO sondare la modalità tratto CD, e un DR-AUTO segnale sondaggio entrambi. </li><li> Selezioniamo ogni picco come descritto nella Sezione 2.3 e scattare una foto come descritto sopra. </li></ol> 5. Image Processing Estrazione di informazioni aggiuntive sulla base di queste tre immagini ora richiede alcuni di elaborazione delle immagini abbastanza semplice. <ol><li> Prima volta le immagini devono essere normalizzati. In teoria la normalizzazione può essere ottenuto contabili per l&#39;intensità di ogni laser coinvolte in ogni processo di generazione del segnale. In pratica, tuttavia questo non sempre funziona, principalmente a causa della non uniforme risposta spettraledi specchi dicroici, rivelatori, e grate. </li><li> Un metodo pratico per la normalizzazione si basa sul fatto che nelle regioni in cui i lipidi puro dominano il segnale, la risonanza CD non dovrebbe contribuire ad uno qualsiasi degli segnale. Allo stesso modo, nelle regioni di soluzione di glucosio puro la risonanza CH non deve contribuire ad uno qualsiasi degli segnale. Con questo in mente, abbiamo normalizzare il DR-CARS immagine e l&#39;immagine CARS ottenuto sulla risonanza CD della soluzione di glucosio deuterati ad una regione ben al di fuori della C. elegans worm che deve presentare nessuna risonanza CH. </li><li> Poi abbiamo identificare una regione all&#39;interno del worm in CH-risonante immagine CARS che è ricco di lipidi e normalizzare alla regione corrispondente nel normalizzato DR-AUTO immagine. Per questo metodo funzioni correttamente assumiamo che profonde in questa regione non deuterati glucosio è presente. Questo è un presupposto sicuro in quanto i lipidi sono idrofobiche e non mescolare con la soluzione. </li><li> Ora, sottraendo il normalizzato CH-risonante immagine AUTO dal normalizzato DR-AUTO immagine che ci rimane solo la amplificato CD-risonante dei segnali. </li><li> Allo stesso modo sottraendo la normalizzato CD-risonante immagine AUTO dal normalizzato DR-FWM immagine che ci rimane solo il CH-risonanza amplificata del segnale. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Schema di DR-CARS sistema di microscopia come descritto sopra. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: immagine di una luce bianca C. verme elegans in soluzione glucosata deuterato preparato su un vetrino di vetro e pronto per l&#39;imaging. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3:. Spettro Raman di acido oleico modificati (un acido grasso insaturo) che include una modifica alchino (un triplo legame carbonio carbonio gruppo) Le risonanze CH forte a 2845 centimetri -1 e la risonanza alchini a 2100 cm -1 sono entrambi ben isolato dalla regione di impronte digitali (la regione di picchi densamente imballato), che li rende marcatori ideali per l&#39;imaging Raman coerenti. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4:. Spettro tipico di segnali coerenti Raman generati quando tre brevi impulsi laser si sovrappongono all&#39;interno del campione Le frecce indicano il processo (i) responsabile per ogni segnale, come rappresentato da diagrammi di energia. Nei diagrammi qui frecce tratteggiate indicano i fotoni del laser e la OPO e le frecce indicano il segnale solido risultante. Le linee continue orizzontali indicano l&#39;energia della vibrazione Raman e dare una rappresentazione visiva che, in DR-CARS, mescolando le stesse 3 fotoni in ingresso sonde contemporaneamente due diverse vibrazioni Raman. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: I risultati tipici dalle immagini C. elegans worm utilizzando DR-AUTO e AUTO. La riga superiore utilizzato i tre segnali indicati in figura 4 per immagine un verme in una soluzione di glucosio deuterati. In seconda fila le immagini sono stati opportunamente normalizzati e in terza fila le immagini sono state prodotte differenza sottraendo ciascuna delle immagini CARS dal DR-CARS immagine.

<ol>
	<li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li><li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+(CARS).">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li><li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions.">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li><li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+(DR-FWM).">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li><li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting.">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Spettroscopia Raman e Raman basato su immagini sono potenti strumenti emergenti nel campo delle scienze bio. Attualmente, questo è particolarmente vero per l&#39;in vivo e in studio in vitro del metabolismo cellulare e disturbi metabolici di lavorazione e stoccaggio dei lipidi. La maggior parte dei bio-macromolecole contengono un gran numero di simili, obbligazioni per lo più a base di carbonio molecolare, in modo che gli spettri Raman ottenuti da cellule e gli organismi sono solitamente una convoluzione dei contributi da lipidi, proteine, acidi nucleici, zuccheri, lipidi, ecc sono relativamente facili per isolare da questi spettri complessi, a causa della loro tendenza a formare gocce dense o doppi strati e perché contengono lunghe catene con un gran numero di legami CH alifatici. La nostra capacità di isolare specifiche proteine, aminoacidi, RNA, o il DNA all&#39;interno dell&#39;ambiente cellulare complesso, tuttavia, è molto limitata. Ciò è particolarmente vero se queste molecole di interesse sono presenti solo a concentrazioni mM e al di sotto. Qui, la capacità di sondare deboli risonanze Raman utilizzando i nostri recente introduzione DR-AUTO tecnica di imaging differenza fornisce un approccio potenzialmente potente per la loro microanalisi chimica e di imaging. Certo, la parte più complicata di questo protocollo è l&#39;allineamento e la sincronizzazione del sistema laser. Quando si inizia da zero, la sincronizzazione degli impulsi, cioè garantire che gli impulsi sono sovrapposte nel tempo, nonostante i diversi percorsi prendono può essere facilitato dall&#39;uso di una autocorrelatore impulsi. Una volta che si sovrappongono spaziale e temporale si ottiene, AUTO e DR-CARS segnali devono essere facilmente rilevabile. Tuttavia, l&#39;allineamento prima è spesso cruda, con conseguente segnali deboli. La pratica migliore per allineare il sistema bene è quello di generare segnali deboli inizialmente e poi per migliorare la potenza del segnale con delicatezza modificando gli specchi lungo ogni percorso e regolando la sovrapposizione temporale con le fasi di ritardo. Anche se lo spettrometro / monocromatore agisce come un diaframma molto efficiente per la luce ambiente il più pulito risultati possono essere raggiunti dal funzionamento del sistema con le luci della stanza spento e tende o tubi obiettivo di ridurre al minimo sfondo introdotta dalle varie fonti di luce di altri (ad esempio monitor di computer, spie luminose, i LED, ecc.) La nostra particolare impostazione utilizza singolo fotone conteggio valanga fotodiodo (APD) rilevatori e correlate nel tempo conteggio singolo fotone (TCSPC) hardware per il rilevamento 5. Questo ci permette di rilevare i segnali estremamente deboli con rumore relativamente basso, ma molti gruppi hanno trovato foto-moltiplicatore tubi (PMT) con guadagno variabile vantaggiosa quando si eseguono misure simili. Il vantaggio di PMT è che essi offrono guadagno variabile e hanno una zona di rilevamento molto più grande che può semplificare l&#39;allineamento del rivelatore. Inoltre, la nostra impostazione utilizza fasi piezo per tradurre l&#39;obiettivo al fine di ottenere la scansione del fascio. Il vantaggio di questo è che abbiamo la possibilità di tornare a qualsiasi punto all&#39;interno dell&#39;immagine acquisita in precedenza con un alto grado di accuratezza e di prendere misure aggiuntive, tra cui spontaneo spettri Raman. Altri gruppi hanno avuto successo utilizzando assemblee mirror di scansione, o addirittura intere unità di scansione confocale come il sistema Olympus FluoView, che offre immagini molto più veloce, ma è limitata nella sua capacità di restituire con precisione in posizioni arbitrarie all&#39;interno di un&#39;immagine. Mettere a punto il laser per abbinare la risonanza Raman è anche un passo fondamentale che può richiedere qualche ottimizzazione. Anche se i picchi Raman si può conoscere l&#39;intensità massima di picco spettrale ottenuti da DR-AUTO CARS e non corrisponde necessariamente al massimo del picco Raman spontaneo. Ciò è dovuto alla interferenza intrinseca di segnali generati da quattro-wave di miscelazione portando ad una non risonante segnale di fondo e auto, che distorce spettri AUTO rispetto alla spontanea spettri Raman. La posizione spettrale del picco del segnale CARS può essere calcolato, ma un approccio più pratico è quello di regolare il OPOS in diversi, piccoli passi spettrale attraverso la posizione prevista della risonanza Raman. Questo processo dovrebbe produrre un massimo chiaro. Infatti, per la massima sensibilità da DR-FWM sia risonanze deve essere sintonizzata a questa massima. Un ultimo problema potenziale del DR-CARS approccio deve anche essere discussa, ovvero il modello DR-CARS segnale dipenderà da una distribuzione omogenea della molecola Raman-attivo di amplificazione. Per la maggior parte degli oggetti biologici, questo potrebbe essere la risonanza ampia OH dall&#39;acqua, che è abbondante e quasi onnipresente. L&#39;acqua è, comunque, esclusi dalle regioni idrofobiche con una cella, come gocce lipidiche, che porta una distorsione del segnale ottenuto quando si utilizza la risonanza acqua per amplificare le modalità dei lipidi. Nel nostro esempio, abbiamo utilizzato una soluzione di glucosio deuterati per generare un segnale facilmente rilevabili e abbondanti per il nostro campione biologico. Allo stesso modo, deuterati acqua o deuterati buffe biologicors, come d-HEPES potrebbero essere utilizzati. Nel nostro esempio, le goccioline lipidiche all&#39;interno del C. verme elegans sono stati abbastanza piccolo per contenere sempre sia, la soluzione deuterati glucosio e lipidi all&#39;interno del punto laser focalizzato del nostro sistema. Questo, tuttavia, non è generalmente vero. Un esempio particolare sarebbe adipociti, che generano gocce lipidiche piuttosto grandi nel loro citoplasma. Ciò significa che, ogni esperimento condotto con il DR-CARS tecnica richiede un&#39;accurata preparazione ed esperimenti di controllo per verificare i risultati.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60X water immersion objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>UPLSAPO 60XW</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>IX-71SIF-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pockels Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ConOptics</td>
<td>350-160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picotrain pump Laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HighQ</td>
<td>IC-1064-10000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optical Parametric Oscillator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>APE</td>
<td>Levante IR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-102 25cm-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Half-wave plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>AHWP05M-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polarizing Beam Splitter Cubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>PBS052 or PBS053</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrometer/Monochromator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>Spectra Pro 2300i</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>PIXIS: 100B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Avalanche Photo Diode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>SPCM-AGR-14-12691</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYZ Piezo Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Physik Instruments</td>
<td>P 733-2CL P 721.CDQ</td>
<td>This is a combination of an XY stage and a Z objective holder</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirrors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td>
<td>These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>Z830rdc</td>
<td>To combine the different near-infrared laser beams</td>
</tr>
<tr>
<td>TCSPC board</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>Timeharp 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Symphotime Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

differential imaging of biological structures with doubly-resonant coherent anti-stokes raman scattering (cars)

Coerente tecniche di imaging Raman hanno visto un drammatico aumento delle attività nell&#39;ultimo decennio a causa della loro promessa di permettere l&#39;etichetta senza l&#39;imaging ottico ad alta specificità molecolare 1. La sensibilità di queste tecniche, tuttavia, è molti ordini di grandezza più debole di fluorescenza, che richiedono milli-molare 1,2 molecolare concentrazioni. Qui, descriviamo una tecnica che può consentire di rilevare basse concentrazioni di debole o di Raman-attivo molecole, amplificando il loro segnale con quello ottenuto da dispersori Raman forti o abbondanti. L&#39;interazione di brevi impulsi laser in un campione biologico genera una varietà di segnali coerenti scattering Raman, ognuno dei quali portano informazioni uniche sulla chimica del campione. In genere, solo uno di questi segnali, ad esempio coerente di lotta alla stokes scattering Raman (CARS), viene usato per generare un&#39;immagine mentre gli altri vengono eliminati. Tuttavia, quando questi altri segnali, di cui 3 colori CARS e quattro-wave mixing (FWM), sono raccolti e confrontati con il segnale di CARS, altrimenti difficili da rilevare informazioni possono essere estratte 3. Per esempio, AUTO doppiamente risonante (DR-AUTO) è il risultato di interferenza costruttiva tra i due segnali di risonanza 4. Noi dimostrare come messa a punto dei tre laser necessaria per produrre DR-CARS segnali al centimetro 2845 -1 vibrazioni tratto CH in lipidi e il CM 2120 -1 vibrazioni CD allungamento di una molecola deuterato (ad esempio zuccheri deuterati, acidi grassi, ecc) può essere utilizzato per sondare sia risonanze Raman contemporaneamente. In queste condizioni, in aggiunta ai segnali CARS da ogni risonanza, un combinato DR-AUTO segnale sondaggio sia anche generato. Dimostriamo come rilevare la differenza tra il modello DR-CARS segnale e il segnale da amplificare le vibrazioni di una molecola abbondante può essere utilizzato per migliorare la sensibilità per il segnale più debole. Abbiamo inoltre dimostrato che questo approccio si estende anche ad applicazioni dove si generano i due segnali di molecole diverse, in modo che ad esempio utilizzando il forte segnale Raman di un solvente può migliorare il segnale debole Raman di un soluto diluito.

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Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Una combinazione di tre singola lunghezza d&#39;onda a breve impulsi laser viene utilizzato per generare coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS) e doppiamente AUTO-risonante (DR-CARS). La differenza tra questi segnali fornisce maggiore sensibilità perché altrimenti difficili da individuare coerenti segnali Raman, che consente l&#39;imaging di debole dispersori Raman.

Imaging differenziale delle strutture biologiche con Doppiamente-risonanza coerente Anti-Stokes scattering Raman (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

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Research

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Biology

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

13.6K Views.  University of California, Davis. Una combinazione di tre singola lunghezza d'onda a breve impulsi laser viene utilizzato per generare coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS) e doppiamente AUTO-risonante (DR-CARS). La differenza tra questi segnali fornisce maggiore sensibilità perché altrimenti difficili da individuare coerenti segnali Raman, che consente l'imaging di debole dispersori Raman.

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Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contrasto di fase e interferenza differenziale contrasto (DIC) Microscopia

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

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Biologia

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Analisi e costruzione di strutture acidi nucleici con 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasma membrana Deformazioni Con pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Recupero di fluorescenza dopo Photobleaching di giallo fluorescente proteine Tagged p62 in Aggresome-come le strutture indotta

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Imaging di cellule vive super-risoluzione di strutture subcellulari

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron spin echo, diffraction, and inelastic scattering. Unlike neutron scattering techniques that obtain information in reciprocal space, attenuation-based neutron imaging measures a signal in real space that is resolved on the order of tens of micrometers. The principle of neutron imaging follows the Beer-Lambert law and is based on the measurement of the bulk neutron attenuation through a sample. Greater attenuation is exhibited by some light elements (most notably, hydrogen), which are major components of biological samples. Contrast agents such as deuterium, gadolinium, or lithium compounds can be used to enhance contrast in a similar fashion as it is done in medical imaging, including techniques such as optical imaging, magnetic resonance imaging, X-ray, and positron emission tomography. For biological systems, neutron radiography and computed tomography have increasingly been used to investigate the complexity of the underground plant root network, its interaction with soils, and the dynamics of water flux in situ. Moreover, efforts to understand contrast details in animal samples, such as soft tissues and bones, have been explored. This manuscript focuses on the advances in neutron bioimaging such as sample preparation, instrumentation, data acquisition strategy, and data analysis using the High Flux Isotope Reactor CG-1D neutron imaging beamline. The aforementioned capabilities will be illustrated using a selection of examples in plant physiology&#160;(herbaceous plant/root/soil system)&#160;and biomedical applications&#160;(rat femur and mouse lung).

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory&#039;s High Flux Isotope Reactor

This manuscript describes a protocol for neutron radiography and computed tomography of biological samples using a High Flux Isotope Reactor (HFIR) CG-1D beamline to measure a metal implant in a rat femur, a mouse lung, and an herbaceous plant root/soil system.

Radiografia neutronica e tomografia computerizzata di sistemi biologici presso il reattore isotopico ad alto flusso dell'Oak Ridge National Laboratory

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron ...