Questo lavoro è stato finanziato dalla NSF premio DBI 0852891. Parte di questo lavoro è stato anche finanziato dal Centro per Biofotonica Scienza e della Tecnologia, un designato NSF Science and Technology Center gestito dalla University of California, Davis, ai sensi del Contratto Cooperative n. PHY0120999.

1. Alcuni bisogna fare attenzione nella preparazione e l&#39;immissione di un campione Raman all&#39;interno di questo sistema. <ol><li> Poiché il sistema fa uso di solito molto alti obiettivi apertura numerica con distanze di lavoro molto brevi, i campioni sono posti su un vetrino. I campioni biologici sono generalmente posto su un vetrino n ° 1 spessore montato in una camera cellula Attofluor (Invitrogen, Carlsbad, CA). </li><li> Campioni liquidi, in particolare quelli tossici per l&#39;uomo, vengono inseriti in una piccola bottiglia di vetro con un coprioggetto cementato l&#39;apertura per mezzo di una resina di silicone. La bottiglia viene poi invertito per la misurazione. </li><li> Perché il nostro sistema dipende dalla tempistica precisa della pompa e gli impulsi del segnale, siamo costretti a non usare la regolazione convenzionale centro del nostro microscopio, che traduce l&#39;obiettivo su e giù. Questa somma e sottrae percorso ottico dal nostro sistema. Invece, abbiamo posto i nostri campioni su un palco secondario montato sulla parte superiore del palco microscopio che ha un proprio controllo messa a fuoco indipendente. </li></ol> 2. Al fine di prendere tempo-dipendenti spettri Raman, il fascio di eccitazione deve essere adeguatamente preparato. <ol><li> Si comincia con la luce che emerge da una W 2,4 sintonizzabile pulsata Ti: Sapph laser (Chameleon, sistemi coerenti, Santa Clara, CA). Ogni impulso del treno di impulsi 80 MHz ha 30 nj di energia, ha una larghezza temporale di 140 fs, ed ha uno spettro centrata a 808 nm con una larghezza di banda spettrale di ~ 6 nm. </li><li> Per evitare di back-riflessioni di rientrare nella cavità laser, la luce passa attraverso un isolatore Faraday. Un semionda piatto posto davanti l&#39;isolatore di Faraday permette la sintonizzazione continua della potenza totale inviato nel sistema. </li><li> Perché 6 nm è troppo ampia larghezza di banda per risolvere i modi di trasporto più Raman, il fascio viene inviato attraverso un molto stretto (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH), filtro passa-banda centrata a 808 nm. </li><li> La luce è poi focalizzata da un doppietto acromatico (f = 100 mm) su un 5 millimetri β-borato di bario (BBO) cristallo (CASIX, Fuzhou, Fujian, Cina) di dimezzare la lunghezza d&#39;onda da 808-404 nm nm. Il cristallo BBO è posto in un monte con controlli punta e inclinazione, ed anche montato su un palcoscenico di traduzione. Per massimizzare l&#39;efficienza della conversione lunghezza d&#39;onda, il cristallo deve essere posta esattamente simmetriche rispetto al centro del doppietto, e con il suo asse di cristallo allineato alla polarizzazione del fascio in entrata. </li><li> Perché l&#39;efficienza della conversione lunghezza d&#39;onda è la polarizzazione-dipendente, il controllo della quantità di luce inviata al campione può essere ottenuta con piazzando una seconda semionda piatto dopo l&#39;isolatore di Faraday. Ruotando questo waveplate, l&#39;intensità della luce inviata al campione può essere regolata in modo indipendente l&#39;intensità del fascio trasmesso pompa (di cui parleremo più avanti). </li><li> La lunghezza d&#39;onda-luce è convertita recollimated da un doppietto acromatico secondo (f = 500 mm) scelto in modo che il fascio di uscita è abbastanza grande da riempire l&#39;apertura posteriore dell&#39;obiettivo microscopio, e diretto in un microscopio invertito (IX-71, Olympus, Center Valley, PA) per mezzo di due specchi di sterzo. </li><li> L&#39;obiettivo microscopio, essendo l&#39;elemento ottico ospitato all&#39;interno del componente più monolitica del sistema, definisce l&#39;asse ottico. Per allineare il fascio di eccitazione a questo asse, uno specchio è inserito nel piano campione del microscopio. I due specchi di sterzo sono poi iterativamente sintonizzati osservando il back-riflesso fascio laser su un CCD cam-era (μEye, IDS, Obersulm, Germania) collegato alla porta di imaging del microscopio. Supponendo che l&#39;immagine sulla fotocamera è incentrata sul microscopio campo di vista, il raggio è in asse, quando il punto focale è centrato sul chip microscopio e la traduzione degli obiettivi lungo l&#39;asse z non cambia il punto centrale del fascio sfocata. </li><li> Quando un campione è posto nel piano di campionamento e irradiati con luce laser scattering Raman si verifica. Un filtro dicroico posto sotto l&#39;obiettivo microscopio separa la lunghezza d&#39;onda in differita luce Raman sparsi (e fluorescenza) dal fascio di eccitazione, dirigendo la luce Raman sparsi per l&#39;attacco laterale del microscopio. Il microscopio è stato modificato per rimuovere le lenti all&#39;interno di questo percorso, in modo che la luce del segnale emerge dal microscopio collimato. </li><li> Poiché il raggio del segnale che emerge dal microscopio è più grande l&#39;apertura chiara del Glan-Thompson polarizzatori, un telescopio 0.47x composto da due doppietti acromatici (= 75 mm f1, f2 = 35 mm) viene utilizzato per ridurre il raggio. </li><li> La luce del segnale viene poi polarizzato da un polarizzatore Glan-Thompson orientati a 0 ° rispetto alla verticale, nella cornice di laboratorio, e diretto a uno specchio dicroico dove viene ricombinato con il fascio di pompa. </li></ol> 3. Affinché il cancello ottico per operare al massimo dell&#39;efficienza, è necessario prestare attenzione nella preparazione del fascio di pompa (Kerr fascio) pure. <ol&gt; <li> L&#39;impulso di pompa viene prima amplificata da 0.35x con un telescopio costruito con due doppietti acromatici (= 35 mm f1, f2 = 100 mm) per adattarsi alle dimensioni finali del raggio del segnale. </li><li> Il fascio di pompa viene poi inviato in una linea di ritardo composta da un prisma ad angolo retto posto su un palco traduzione lineare che può essere regolato per garantire la sovrapposizione temporale degli impulsi di pompa e di segnale (messa a punto da discutere più avanti). </li><li> Dopo la linea di ritardo, il fascio viene inviato attraverso una semionda piastra e polarizzatore orientato a 45 ° rispetto alla verticale, nella cornice di laboratorio. In questo modo il proprio stato di polarizzazione del fascio di pompa quando raggiunge il medium non lineare. </li><li> La luce viene poi riflessa da due specchi di sterzo, uno con piezo-elettrico di controllo, che vengono utilizzati per regolare con precisione la posizione del fascio di pompa in modo tale che si sovrappone spazialmente con il raggio del segnale. La sovrapposizione si ottiene osservando la pompa e travi di segnale in due luoghi, uno vicino e uno lontano dallo specchio dicroico in cui si combinano le travi. Usando il primo specchio di sterzo a sovrapporre i due fasci nel punto vicino, e lo specchio piezo di sovrapporre i fasci nel punto lontano, il fascio di pompa può essere fatto esattamente allineati con il raggio del segnale. </li><li> Con i due fasci combinati, il cancello Kerr e il sistema di raccolta sono impostati per massimizzare il tempo-dipendenti raccolti segnale. </li></ol> 4. Con i due fasci combinati, il cancello Kerr e il sistema di raccolta sono impostati per massimizzare il tempo-dipendenti raccolti segnale. <ol><li> Le travi pompa e segnale vengono prima passare attraverso un filtro dicroico che ha un diametro di 6 a 404 nm per evitare qualsiasi luce residua eccitazione da emozionanti scattering Raman all&#39;interno del mezzo non lineare. </li><li> La pompa e le travi del segnale sono poi entrambe focalizzate da un doppietto acromatico (f = 35 mm) in una cuvetta di 1 centimetro cammino ottico di quarzo contenente il materiale non lineare. Qualsiasi materiale non lineare con un alto indice opportunamente non lineare (superiore CS 2), opportunamente breve risposta temporale (&lt;2 ps), possono essere utilizzati qui. Per questi esperimenti, usiamo disolfuro di carbonio, CS 2, che ha un indice non lineare n 2 = 3.1 x 10 -18 m 2 / W. La luce viene poi recollimated da un doppietto secondo con una lunghezza focale identico al primo. </li><li> Le travi sono poi passati e Glan-Thompson analizzatore su un supporto rotante, e poi attraverso una serie di filtri di assorbimento e le interferenze che combinati hanno un diametro esterno di 10 a 808 nm. </li><li> Infine, la luce del segnale è focalizzata da un doppietto acromatico (f = 35 mm) in un micron 50 fibra ottica multimodale, in cui è montato la fibra in una fase che permette la traduzione in x, y, z. La fibra viene poi accoppiato ad uno spettrografo di imaging commerciale con annesso CCD (SP2300i e Pixis 100B, rispettivamente, sia prodotto da Princeton Instruments, Trenton, NJ). </li><li> Per allineare il sistema di raccolta per massimizzare il segnale raccolto, l&#39;analizzatore è impostato a 0 ° e un campione di toluene viene inserito nel piano di campionamento. Regolando la x, y, z e controlli del monte fibra, il segnale raccolto Raman è ottimizzato. </li><li> Per assicurare una corretta sovrapposizione spaziale e temporale della pompa e travi di segnale, uno specchio è inserito nel piano campione del microscopio. Il filtro di 404 nm viene rimosso dal sistema. Con l&#39;analizzatore ruotato di 90 ° il fascio retroriflessa nm 404 è inviato nel spettrografo con l&#39;intensità regolato in modo da non saturare la fotocamera. Con il fascio pompa spenta, l&#39;analizzatore viene ruotato per ridurre al minimo la trasmissione del segnale nm 404. Con il fascio di pompa riaccesa, la fase di ritardo è sintonizzato lentamente fino a quando la trasmissione della luce 404 nm comincia ad aumentare. Allora, per iterativamente messa a punto la fase di ritardo, il piezoelettrico specchio, e la x, y, z e controlli della fibra, si massimizza il segnale. </li><li> Poiché il retro-riflessa 404 nm e il fascio di luce Raman sparsi possono prendere strade leggermente diverse attraverso il sistema, le regolazioni finali sono realizzati mettendo una forte Raman diffusore (come il toluene) sul palco del campione e la messa a punto leggermente l&#39;allineamento cambiando il fase di ritardo, piezeo elettrici specchio e controlli x, y, z della fibra di ottimizzare il segnale Raman. </li></ol> 5. Raccolta di un singolo time-gated spettro Raman richiede l&#39;acquisizione di spettri diversi per correggere gli artefatti del sistema. <ol><li> Con l&#39;analizzatore a 0 °, il fascio di eccitazione e la trave sulla pompa off, uno spettro &quot;ungated&quot; è tratto, che rappresenta lo spettro che sarebbero stati acquisiti senza il beneficio del tempo-gating sistema. </li><li> Con l&#39;analizzatore impostato a 90 °, il fascio di eccitazione e il fascio di pompa ancora fuori, un back-ground spettro è presa, che rappresenta la quantità di luce parassita che cola attraverso la polarizzatori e gli altri elementi del sistema. </li><li> Con l&#39;analizzatore rimanenti a 90 °e tutte le travi in ​​poi, lo spettro di &quot;gated&quot; è tratto, che rappresenta la luce Raman sparsi consentito attraverso i polarizzatori attraversato dalla presenza del fascio di pompa. </li><li> Infine, con l&#39;analizzatore ancora a 90 °, il fascio di eccitazione fuori e il fascio di pompa, uno spettro di fondo secondo è preso, che rappresenta il contributo allo spettro di &quot;gated&quot; di somme residue di luce 808 nm entrare nel spettrografo. </li><li> Inoltre, uno spettro è presa con tutti i laser spento, che caratterizzano il livello di base &quot;oscura&quot; il segnale della telecamera ed elettronica. </li><li> Poiché gli spettri spesso richiedono lunghi tempi di integrazione, è indispensabile rompere questo tempo di integrazione in vari pezzi (fotogrammi) per consentire la correzione adeguata dei raggi cosmici - un problema comune quando l&#39;acquisizione di dati su campate di diversi minuti. </li></ol> 6. Una volta acquisito, fasi di lavorazione diverse sono utili per migliorare la qualità e l&#39;aspetto dei dati. <ol><li> In primo luogo, tutti gli spettri sono scure corretti sottraendo al largo spettro &quot;dark&quot;. </li><li> Per correggere i raggi cosmici, i diversi frame che costituisce una acquisizione sono confrontate tra di loro su un pixel-by-pixel. Per ogni pixel di ogni fotogramma che cade al di fuori di 2 deviazioni mediana dal valore medio per quel pixel su tutti i fotogrammi, valore pixel è sostituito dal valore medio su tutti i fotogrammi. </li><li> Le cornici dei raggi cosmici vengono poi corretti media e levigate da un Savitzky-Golay filtro 1. </li><li> Per estrarre lo spettro di &quot;vero&quot; gated, sottraiamo il &quot;eccitazione-only&quot; e &quot;pompa-only&quot; spettri dallo spettro misurato gated. </li><li> Infine, gli spettri gated e ungated sono poi di fondo corretta sottraendo una 5 ° ordine polinomiale, determinato con il metodo di Lieber e Mahadevan-Jansen 2. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Schema del sistema di gating Kerr. Il percorso del fascio pompa è mostrato in rosso, mentre il percorso SHG è mostrata in blu. Il percorso in cui si sovrappongono Raman e di fluorescenza viene evidenziato in verde, mentre il percorso in cui la fluorescenza è stata temporalmente filtrati è evidenziata in giallo. Abbreviazioni come segue: BPF, filtro passa banda, CCD, Charge-Coupled Device, DCM, specchio dicroico, FI, Faraday isolatore; λ / 2, onda piastra metà, LPF, filtro passa-tempo; NLM, non lineare media; P, polarizzatore ; SHG, cristallo generazione di seconda armonica. <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2 Top:. Spettri gregge di cumarina disciolto in olio di immersione. Curva rossa mostra lo spettro prese con la porta tenuta aperta (analizzatore impostato per la massima trasmissione). Curva nera mostra lo spettro preso con l&#39;analizzatore in linea per la trasmissione minima ed una pompa applicata fascio (lo spettro gated). Curva blu mostra l&#39;spectum prese con l&#39;analizzatore in linea per la trasmissione minimo e nessuna pompa fascio applicato (porta tenuta chiusa). Curva verde mostra lo spettro presa solo con il fascio di pompa applicata. Linee tratteggiate indicano magenta regione spettrale mostrata nel pannello in basso. Tutti gli spettri sono stati smussati con una punto 11, 3 ° ordine Savitzky-Golay filtro. In basso: spettri di cumarina disciolto in olio di immersione dopo fluorescenza di fondo sottrazione. Curva rossa è lo spettro con la porta tenuta aperta, e la curva blu è lo spettro gated. Lo spettro gated mostra chiaramente il contorto alto numero d&#39;onda caratteristica di punta di oli.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il campo della ricerca biomedica spettroscopia Raman ha visto un crescente interesse negli ultimi anni come risultato del suo potenziale dimostrata per risolvere diverse sfide difficili nella diagnostica biologica. Per esempio, spettri Raman hanno dimostrato di avere valore diagnostico nel cancro della rilevazione 3, 4, 5, 6. Spettroscopia Raman è stata utilizzata anche nella quantificazione batterica 7, 8 e risposta ai farmaci dei batteri 9. Inoltre ha trovato applicazione in una vasta...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Lenti </td><td> Thorlabs </td><td> Vari </td><td> Tutte le lenti rivestiti di avere perdite di trasmissione massima di 1% ciascuno </td></tr><tr><td> Ti sintonizzabile: Sapph laser </td><td> Coerente </td><td> Camaleonte </td><td> NJ 30, 200 fs, 80 MHz </td></tr><tr><td> 40X olio obiettivo ad immersione </td><td> Olimpo </td><td> UApo/340 </td><td> NA = 1,35 </td></tr><tr><td> Microscopio invertito </td><td> Olimpo </td><td> IX-71 </td><td> Modificato per rimuovere tutti gli obiettivi a babordo </td></tr><tr><td> Mezza onda piastra </td><td> Thorlabs </td><td> AHWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> Glan-Thompson polarizzatore </td><td> Thorlabs </td><td> GTH10M </td><td> ~ Perdita di trasmissione del 10% </td></tr><tr><td> Spettrometro </td><td> PI Acton </td><td> SP2300i </td><td></td></tr><tr><td> CCD </td><td> PI Acton </td><td> Pixis 100B </td><td></td></tr><tr><td> Software Mathmatical </td><td> The MathWorks </td><td> MATLAB </td><td> versione 2008a </td></tr><tr><td> Faraday isolatore </td><td> EOT </td><td> BB8-5I </td><td></td></tr><tr><td> Piezoelettrico specchio </td><td> Newport </td><td> AG-M100 </td><td></td></tr><tr><td> BBO cristallo </td><td> CASIX </td><td> costume </td><td> 1 millimetro di spessore </td></tr><tr><td> Passabanda filtro 1 </td><td> Andover </td><td> 008FC14 </td><td> 808 ± 0,4 nm </td></tr><tr><td> Specchio dicroico </td><td> Semrock </td><td> FF662-FDI01 </td><td> limite di banda a 662 nm </td></tr><tr><td> Lungo filtro passa- </td><td> Semrock </td><td> BLP01-405R </td><td> limite di banda a 417 nm </td></tr><tr><td> Passabanda filtro 2 </td><td> Semrock </td><td> FF02-447/60 </td><td> 417-447 nm </td></tr><tr><td> CS 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 335266 </td><td> 99% di purezza </td></tr><tr><td> Cumarina 30 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 546127 </td><td> 99% di purezza </td></tr><tr><td> Olio di immersione </td><td> Cargille </td><td> 16242 </td><td> Tipo di DF </td></tr></tbody></table>

rejection of fluorescence background in resonance and spontaneous raman microspectroscopy

Spettroscopia Raman è spesso afflitto da un forte background fluorescente, in particolare per i campioni biologici. Se un campione viene eccitato con un treno di impulsi ultraveloci, un sistema che può separare spettralmente temporalmente sovrapposti segnali su una scala temporale picosecondo possibile isolare tempestivamente arriva Raman luce diffusa dal tardo arrivo luce di fluorescenza. Qui si discute la costruzione e gestione di un complesso sistema ottico non lineare che utilizza tutte le ottiche di commutazione nella forma di una bassa potenza ottica Kerr porta per isolare i segnali Raman e di fluorescenza. Un singolo laser 808 nm con 2,4 W di potenza media e 80 MHz, frequenza di ripetizione è diviso, con circa 200 mW di luce 808 nm di essere convertito in &lt;5 mW luce di 404 nm inviato il campione di eccitare scattering Raman. I restanti non convertito luce 808 nm viene poi inviato ad un mezzo non lineare, dove funge da pompa per il tutto-ottica dell&#39;otturatore. L&#39;otturatore si apre e si chiude in 800 fs con un&#39;efficienza di picco di circa il 5%. Utilizzando questo sistema siamo in grado di separare con successo segnali Raman e di fluorescenza ad un tasso di ripetizione 80 MHz utilizzando energie del polso e medie potenze che rimangono biologicamente sicuri. Poiché il sistema non ha alcuna capacità di ricambio in termini di potenza ottica, abbiamo dettaglio diverse considerazioni di progettazione e di allineamento che aiutano nella massimizzare il throughput del sistema. Discutiamo anche nostro protocollo per ottenere la sovrapposizione spaziale e temporale del segnale e travi pompa all&#39;interno del mezzo Kerr, nonché un protocollo dettagliato per l&#39;acquisizione dello spettro. Infine, si segnala un paio di risultati rappresentativi degli spettri Raman ottenuti in presenza di una forte fluorescenza utilizzando il nostro tempo-gating sistema.

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Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Discutiamo la costruzione e gestione di un complesso sistema ottico non lineare che utilizza ultraveloci tutto-ottici di commutazione per isolare Raman da segnali di fluorescenza. Utilizzando questo sistema siamo in grado di separare con successo segnali Raman e di fluorescenza utilizzando le energie del polso e medie potenze che rimangono biologicamente sicuri.

Rifiuto di fluorescenza di fondo in risonanza e spontanea microspettroscopia Raman

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

rejection-fluorescence-background-resonance-spontaneous-raman

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Views.  University of California, Davis. Discutiamo la costruzione e gestione di un complesso sistema ottico non lineare che utilizza ultraveloci tutto-ottici di commutazione per isolare Raman da segnali di fluorescenza. Utilizzando questo sistema siamo in grado di separare con successo segnali Raman e di fluorescenza utilizzando le energie del polso e medie potenze che rimangono biologicamente sicuri.

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Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Lifetime Imaging di fluorescenza di rotori molecolari nelle cellule viventi

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Ricerca

Bioingegneria

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Luminescence Resonance Energy Transfer allo Studio conformazionale Cambiamenti nella membrana proteine ​​espresse in cellule di mammifero

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Formazione spontanea e riorganizzazione delle reti di Nanotube del lipido artificiale come un modello Bottom-Up per il reticolo endoplasmico

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo Imaging di tessuti biologici con fluorescenza combinata a due fotoni e microscopia a dispersione Raman stimolata

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

In tempo reale, a due colori stimolato Raman Scattering Imaging del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...