Questo saggio in vitro dimostra la germogliazione angiogenica in una piattaforma ad alta produttività e scalabile. Questo potrebbe essere usato per trovare nuovi bersagli nell'angiogenesi. Questo test di angiogenesi combina complessi micro ambienti cellulari che includono gradienti e perfusione con una piattaforma compatibile con lo screening ad alta produttività.
L'angiogenesi gioca un ruolo importante sia nella salute che nelle malattie. Comprendere i meccanismi che si verificano durante l'angiogenesi potrebbe aiutarci a capire come crescono i tumori e come riparano i tessuti. Questo metodo potrebbe fornire informazioni sui meccanismi durante le malattie cardiovascolari e la rigenerazione dei tessuti.
In entrambi, l'angiogenesi gioca un ruolo importante. Per l'uso per la prima volta di questa piattaforma microfluidico, è necessario essere consapevoli della legge dei volumi e di come pipettare. È possibile confermare i passaggi guardando al microscopio o capovolgendo la piastra.
Alcuni passaggi sono difficili da capire quando si legge solo il metodo, ad esempio quanto sono piccoli i canali microfluidici o come tenere la piastra. A dimostrare queste procedure sarà Wendy Stam, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare, trasferire la piastra microfludica da 384 po 'su una cappa sterile a flusso laminare.
Rimuovere il coperchio e aggiungere 50 microlitri di acqua o soluzione salina tamponata con fosfato a ciascuno dei 40 pozzi di osservazione utilizzando una pipetta multicanale. Quindi aggiungere 1,5 microlitri di quattro milligrammi per collagene millilitro una soluzione all'ingresso gel di ogni unità microfluidico. Assicurarsi che la goccia di gel sia posizionata al centro di ogni pozzo affinché il gel entri nel canale.
Dopo aver riempito cinque unità microfluidiche, capovolgere la piastra per ispezionare visivamente il corretto riempimento dei canali del gel. Posizionare la piastra microfludica in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 10 minuti per polimerizzare quella di collagene. Quindi estraere il piatto dall'incubatrice e trasferirlo in una cappa di flusso laminare sterile.
Aggiungere 50 microlitri di 10 microgrammi per soluzione di codifica della fibronecina millilitro al pozzo di uscita del canale di perfusione superiore di ogni unità microfluidica. Premere la punta della pipetta contro il lato del pozzo per il corretto riempimento del pozzo senza intrappolare bolle d'aria. Il canale si riempie e le padelle liquide sull'uscita senza riempire bene l'uscita.
Quindi posizionare la piastra nell'incubatrice per almeno due giorni. Ora, scongelare rapidamente gli IPSC-EC congelati per meno di un minuto in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Quindi trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e aggiungere lentamente 10 millilitri di mezzo basale per diluire.
Disegnare 10 microlitri della soluzione e contare le celle su un contatore di celle. Centrifugare il tubo a 100 volte g per cinque minuti. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare e risosopend in mezzo basale per produrre una concentrazione di due volte 10 alla settima cella per millilitro.
Successivamente, trasferire la piastra microfluidico da 384 porri dall'incubatrice a una cappa di flusso laminare sterile. Aspirare la soluzione di codifica della fibronectina dall'uscita di perfusione e aggiungere 25 microlitri di mezzo basale nei pozzi di uscita. Aggiungere una goccia di sospensione cellulare a un microlitro ad ogni pozzetto di ingresso perfusione superiore.
La goccia si appiattisce in pochi secondi. Verificare al microscopio se la semina è omogenea all'interno di un singolo canale e tra i canali. Incubare la piastra del pozzo microfluidico per una o 1,5 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Successivamente, controlla le cellule per confermare che hanno aderito. Rimuovere il mezzo basale dai pozzi di uscita perfusione superiore. Aggiungere il mezzo di coltura del vaso caldo nell'ingresso e nell'uscita della perfusione superiore.
Posizionare la piastra su una piattaforma rocker impostata su un angolo di sette gradi e otto minuti di intervallo di dondolo nell'incubatore. Al primo giorno e due post-seeding, immagini la piastra utilizzando un microscopio Brightfield con stadio automatizzato per confermare la vitalità cellulare. Dopo due giorni, un monostrato confluente si è formato contro l'impalcatura di collagene.
In primo luogo, preparare 4,5 millilitri di mezzo di germinazione angiogenica integrando 4,5 millilitri di mezzo basale con 4,5 microlitri di calcio VEGF, 4,5 microlitri di stock di PMA e 2,25 microlitri di stock S1P. Preparare 8,5 millilitri di mezzo di crescita dei vasi integrando il mezzo basale con 5,1 microlitri di VEGF e 3,4 microlitri di BFGF. Aspirare il mezzo dai pozzi e aggiungere 50 microlitri di mezzo di coltura di recipienti freschi nei pozzi di ingresso e uscita perfusione superiore e nei pozzi di ingresso e uscita in gel.
Quindi aggiungere 50 microlitri di miscela di germogli angiogenici a ciascuno dei pozzi di ingresso e uscita del canale di perfusione inferiore. Riposizionare la piastra nell'incubatore sulla piattaforma del rocker per formare un gradiente di fattori di crescita angiogenici. Un giorno e due giorni dopo l'aggiunta dei fattori di crescita angiogenici, utilizzare un microscopio Brightfield per immagini i pozzi su uno stadio automatizzato.
Per studiare l'anastomosi e la stabilizzazione del germoglio, aggiungere un microlitro di 0,5 milligrammi per millilitro etichettato fluorescentmente albumina all'ingresso perfusione superiore. Quindi mescolare la soluzione con una pipetta da 50 microliter. Trasferire la piastra su un microscopio fluorescente con stadio automatizzato e incubatore impostati a 37 gradi Celsius.
Impostare il microscopio all'obiettivo 10X e correggere le impostazioni di esposizione. Acquisire immagini timelapse ogni minuto per 10 minuti. Rimuovere la piastra dal microscopio e trasferire la piastra in un cappuccio di flusso laminare sterile.
Rimuovere tutto il mezzo dai pozzi e sostituire sia il mezzo di coltura del recipiente che il mezzo di germogliazione angiogenico nei pozzi corrispondenti. Riposizionare la piastra microfluidica nell'incubatrice per continuare la germinazione angiogenica. Il sesto giorno, ripeti l'imaging per studiare la permeabilità.
Per fissare la coltura cellulare, aspirare tutti i mezzi di coltura dai pozzi. Aggiungere 25 microlitri del 4%PFA in PBS a tutti i pozzi di ingresso e uscita perfusione. Quindi posizionare un lato della piastra microfluidica sul coperchio con un leggero angolo di cinque gradi per indurre il flusso.
Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopodiché, aspira la PFA dai pozzi. Lavare tutte le insenature e uscite perfusione due volte con 50 microlitri di HBSS.
Quindi aspirare l'HBSS dai pozzi. La paraformaldeide è una sostanza chimica pericolosa che deve essere maneggiata indossando guanti e aperta solo in un cappuccio dei fumi. Aggiungere quindi 50 microlitri dello 0,2% di tensioattivi non ionici a tutte le insenature e uscite perfusione per permeabilizzare a temperatura ambiente per 10 minuti e posizionare la piastra microfluidica sul coperchio con un leggero angolo di cinque gradi.
Aspirare il tensioattivo non ionico dai pozzi e lavare due volte i canali di perfusione aggiungendo 50 microlitri di HBSS a tutti i pozzi di ingresso e uscita perfusione. Aspirare l'HBSS dai pozzi. Preparare la Hoechst 1.000-2.000 per la colorazione dei nuclei e preparare la Phalloidin da 100 a 200 in HBSS per la colorazione dell'F-actin.
Combina sei millilitri di HBSS, 30 microlitri di F-actin e tre microlitri di Hoechst in un tubo Falcon. Quindi aggiungere 25 microlitri ad ogni ingresso perfusione e prendere bene. Posizionare la piastra sotto un leggero angolo e incubare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.
Lavare due volte con 50 microlitri di HBSS in tutte le insenature e uscite perfusione. Quindi immagine diretta utilizzando un microscopio fluorescente con stadio automatizzato o conservare la piastra protetta dalla luce a quattro gradi Celsius per un uso successivo. In questo protocollo, i micro recipienti sono stati continuamente perfusi ed esposti a un gradiente di fattori di crescita angiogenici.
La semina degli IPSC-EC utilizzando il metodo di pompaggio passivo ha portato a densità omogenee di semina. La timelapse di una goccia che viene posizionata sopra l'ingresso del canale microfluidico mostra la goccia subito dopo l'aggiunta, la goccia sopra il tronco di ingresso dopo l'aggiunta, fino a quando il menisco gocciolatore è stato appuntato dall'ingresso che ha portato a un flusso verso l'uscita. L'esposizione a un gradiente di fattori angiogenici ha portato alla germogliazione angiogenica direzionale dei micro vasi all'interno del collagene modellato un gel.
La formazione di cellule a punta chiara e l'invasione nel collagene un gel era visibile 24 ore dopo l'aggiunta del gradiente angiogenico mentre le cellule stock, compresa la formazione di lume, erano visibili dopo 48 ore. Dopo la fissazione e la colorazione, sono stati identificati la forma e la lunghezza di questi germogli. Tuttavia, senza aggiunta di fattori di crescita, non è stata osservata alcuna invasione nel gel di collagene.
Con l'imaging confocale, è stato determinato il diametro del germoglio e la formazione di lume è stata confermata. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per migliorare la ricerca di nuovi inibitori angiogenici. Questo potrebbe aiutare a trovare nuovi trattamenti contro la retinopatia diabetica, l'artrite reumatoide e il cancro.
Attualmente stiamo esplorando come possiamo creare co-culture tra cui un modello della barriera ematica e degli organoidi vascolarizzati.
