Il nostro protocollo fornisce un metodo semplice per la coltura cellulare 3D ed è altamente suscettibile all'analisi a valle. Ciò facilita la valutazione di campioni di pazienti eterogenei e delle loro risposte specifiche ai farmaci. Il vantaggio di questa tecnica è che gli sferoidi possono essere formati da piccoli numeri cellulari, consentendo sia la conservazione di campioni primari scarsi, sia lo screening ad alta produttività per le risposte ai farmaci specifiche del paziente.
Il modello di goccia appesa crea un ambiente fisiologico con diffusione del farmaco 3D e fa risposte corrispondenti allo stadio tumorale. Ciò consente lo sviluppo di terapie mirate e trattamenti specifici per il paziente. Questo metodo è ideale per studiare il cancro alle ovaie, l'eterogeneità e lo sviluppo della resistenza alla chemio.
Tuttavia, può anche essere utilizzato per studiare altri tumori e popolazioni cellulari resistenti ai farmaci. Quando si placcano sferoidi, è importante pipettare volumi precisi. Ciò garantisce la coerenza tra gli sferoidi.
Gli sferoidi e le rispettive goccioline sono intrinsecamente fragili e facilmente persi senza una corretta manipolazione, quindi mostreremo come placcare, mantenere e analizzare in modo appropriato una piastra di goccia appesa. A dimostrare questa procedura sarà Michael Bregenzer, uno studente laureato del nostro laboratorio. Inizia riempiendo ogni pozzo della piastra di sei pozzi con da quattro a cinque millilitri di acqua deionizzata in autoclave e incastranando la piastra di caduta sospesa tra il coperchio e il fondo del piatto.
Aggiungere da 800 a 1000 microlitri d'acqua intorno al bordo della piastra di caduta sospesa per fornire un ambiente umido e ridurre al minimo l'evaporazione. Quindi, raccogli le cellule coltivate in 2D staccandole con tripside e quindi aggiungendo sei o otto millilitri di mezzo contenente FBS. Aspirare le cellule con la pipetta sierologica da 10 millilitri e depositarle in un tubo conico da 15 millilitri.
Usa un emocitometro per contare le cellule. Preparare la sospensione cellulare secondo le indicazioni del manoscritto e mescolare delicatamente con la pipetta per garantire una distribuzione omogenea. Posizionare la punta della pipetta nel pozzo con un angolo di 45 gradi e pipettare 20 microlitri di sospensione in ogni goccia appesa bene.
Riposizionare il coperchio della piastra a sei po', quindi utilizzare una striscia termoplastica elastica per sigillare i bordi. Incubare in un incubatore umidificato di anidride carbonica standard e nutrire le gocce appese ogni due o tre giorni aggiungendo da due a tre microlitri di mezzo di coltura cellulare a ciascun pozzo contenente sferoidi. Per quantificare la proliferazione e la vitalità delle cellule, aggiungere due microlitri di soluzione filtrata a base di resazurina ai pozzi designati per l'analisi della proliferazione e incubare secondo la direzione del manoscritto.
Dopo il periodo di incubazione, aprire il sandwich a goccia appeso in un armadio di biosicurezza e portare la piastra del pozzo 384 con il coperchio ancora in posizione al lettore di piastre. Mettilo nel lettore di lastre e leggi il piatto. Salvare l'esperimento nella finestra popup ed esportare i dati in un foglio di calcolo.
Riportare la piastra alla base di sei pozzi e posizionarla nell'incubatore. Una volta che tutti i punti di tempo sono stati letti per il giorno, rigillare la piastra prima di incubare. Per preparare gli sferoidi per l'analisi della citometria del flusso, utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per raccoglierli da ogni pozzo e depositarli in un tubo conico da 15 millilitri per la disaggregazione.
Sospensione cellulare aliquota in cinque tubi di micro centrifuga in modo che ogni tubo contenga almeno 50.000 celle. Centrifugare i tubi a 400 volte G per cinque minuti in un microcentrifugo, quindi aspirare il supernatante e sospendere di nuovo i pellet in 100 microlitri di tampone Aldefluor. Etichettare i tubi in base alle indicazioni manoscritte.
Aggiungere 0,5 microlitri di anticorpo isotipo APC al tubo ISO APC e un microlitro di anticorpo CD133 sul tubo ALDH CD133. Aggiungere quindi cinque microlitri di reagente DEAB e 0,5 microlitri di ALDH al tubo DEAB e un microlitri di ALDH al tubo ALDH CD133. Vortice tutti i tubi per alcuni secondi e incubarli a 37 gradi celsius per 45 minuti.
Dopo l'incubazione, vortice tutti i tubi di nuovo e centrifugarli a 400 volte G per cinque minuti. Etichettare i tubi FACS secondo le indicazioni manoscritte e riempire un contenitore di schiuma isolato con ghiaccio. Aspirare il supernatante dai tubi a microcentrifugo.
Quindi sospendere di nuovo il controllo non macchiato in 400 microlitri di buffer FACS e il resto delle celle in 400 microlitri del buffer FACS DAPI. Posizionare i tubi sul ghiaccio fino a quando non possono essere analizzati su un citometro a flusso. Utilizzare FlowJo per analizzare i dati dal citometro di flusso.
Fate doppio clic sul file non macchiato e impostate l'asse Y sull'altezza di dispersione laterale o SSCH e l'asse X per inoltrare l'altezza di dispersione o FSCH. Fare clic sul pulsante T accanto a ciascun asse per regolare la scala e massimizzare la separazione tra le diverse popolazioni di celle. Fare quindi clic sul pulsante Poligono Gating, disegnare il poligono attorno alla popolazione cellulare ed etichettare le celle di popolazione.
Fare doppio clic sulla popolazione della cella nel workspace, quindi modificare l'asse FSC in larghezza FSC e l'asse SSC sull'altezza FSC. Scegliere il cancello rettangolo per disegnare solo un rettangolo attorno alla popolazione densa di celle più a sinistra, che si estende sull'intero asse Y. Etichettare questo cancello Celle singole.
Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e copiare queste celle nel gate Celle singole nidificate e incollarle sotto ogni campione nell'area di lavoro. Fare doppio clic sul gate Celle singole annidato sotto l'esempio DAPI per visualizzare la popolazione di singole celle da tale tubo campione. Modificate il canale dell'asse FSC nel canale dell'area DAPI e modificate il canale dell'asse SSC in istogramma.
Fate clic sul pulsante T accanto all'asse DAPI e fate clic su Personalizza asse (Customize Axis) per regolare la scala e massimizzare la separazione tra picchi negativi DAPI e DAPI negativi. Fare clic su Applica nella finestra popup e scegliere il pulsante Porta intervallo. Diffondilo sul picco negativo DAPI ed etichetta questo gate Live Cells.
Copiare il gate Live Cells e incollarlo sotto il gate Single Cells, sotto i tubi APC ISO DEAB e ALDH CD133, per selezionare la stessa porzione di cellule vive in ogni tubo. Quindi fare doppio clic sulla popolazione di celle vive nidificata sotto il file di esempio ISO APC e passare dall'asse X all'area ALDH e dall'asse Y all'area APC. Applicare il cancello del quadrante e regolare l'intersezione del cancello, ad esempio che circa lo 0,5% della popolazione si trova in alto a sinistra della finestra del tracciato.
Quindi denominare i quadranti come desiderato, quindi copiare e incollare i cancelli del quadrante nella popolazione di celle vive nidificata sotto il file DEAB e regolare la linea verticale in modo che circa lo 0,15% della popolazione cellulare si trovi all'interno del quadrante positivo ALDH. Infine, copiare e incollare i cancelli del quadrante nei file ALDH CD133 Live Cells population e valutare le proporzioni delle cellule staminali tumorali in base alle proporzioni di ALDH e CD133. Questo protocollo può essere utilizzato per l'analisi ad alta produttività delle cellule staminali tumorali derivate dal paziente.
Solo 10 cellule per pozzo possono formare sferoidi affidabili e man mano che le cellule proliferano, gli sferoidi si espandono di dimensioni. La capacità di proliferazione può essere facilmente quantificata con un saggio di florescence a base di resazurina. L'effetto dei farmaci sulla morfologia degli sferoidi può essere visualizzato con l'imaging a contrasto di fase e quantificato confrontando la florescenza della resazurina nelle cellule non trattate e trattate.
La morte cellulare può essere convalidata mediante l'aggiunta di Calcein-AM e dell'omodimero dell'etidio I agli sferoidi, seguita dall'imaging al microscopio confocale. Infine, gli sferoidi possono essere raccolti e dispersi in un'unica sospensione cellulare per l'analisi con citometria a flusso, che consente di discernere l'efficacia di diversi trattamenti farmacologici su specifiche popolazioni cellulari. Per evitare perdite di goccioline, evaporazione media e variazione delle dimensioni dello sferoide, è importante maneggiare le piastre con attenzione, pipettare con precisione e sigillare completamente le piastre di caduta appese.
Per valutare i cambiamenti nell'espressione genica e nella segnalazione solubile dovuti al trattamento farmacologico, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e i test immunoassorbenti legati all'enzima, possono essere utilizzati per facilitare lo sviluppo di terapie. Questa tecnica consente alle ricerche in oncologia, medicina di precisione e sviluppo di farmaci di esplorare l'eterogeneità intra e interparitiva e la resistenza alla chemio attraverso lo screening farmacologico ad alta produttività di piccole biopsie. Quando si esegue questo protocollo, assicurarsi di indossare tutti i dispositivi di protezione individuale standard.
Compresi guanti, occhiali di sicurezza, cappotti da laboratorio, pantaloni e scarpe a punta stretta.
