L'obiettivo generale del seguente video è dimostrare l'uso della libreria epigenetica di shRNA aggregata per condurre uno screening di selezione negativa. Questo screening consente di identificare specifici bersagli epigenetici attraverso il sequenziamento. Questa procedura potrebbe aiutare a identificare i fattori epigenetici responsabili della mediazione della resistenza acquisita alla citarabina nella LMA I passaggi sono i seguenti.
Selezione del promotore più potente per ottenere un'espressione persistente e prolungata degli shRNA. L'attuale protocollo si concentra sullo screening RNAi utilizzando la libreria di shRNA del fattore epigenetico nella linea cellulare MV4-11 resistente alla citarabina. I promotori utilizzati per questo scopo sono EF-1 alfa umano, CMV umano e SFFV, promotori che esprimono proteine di fluorescenza verde.
Prendi il conteggio delle celle usando il metodo di esclusione blu trypan. Sospendere le celle in un mezzo 10%RPMI contenente 8 microgrammi per mL di polibrene. Semina 1 milione di cellule in 1,5 ml di mezzo per pozzetto di una piastra a sei pozzetti in triplicati.
Aggiungi diversi volumi di lentivirus concentrati. Ad esempio, i lentivirus, ad esempio, 10, 20 e 40 microlitro, a seconda del titolo dei lentivirus per ciascun pozzo. Ruotare delicatamente il piatto per mescolare il contenuto.
Eseguire spinfection per centrifugazione a 920 g a 37 gradi centigradi per 90 minuti. Incubare immediatamente le piastre in un incubatore di anidride carbonica. Osservare la GFP alla fine di 48 ore e quantificare la stessa alla fine di 72 ore.
Quindi, segui i passaggi come illustrato nel diagramma di flusso per scegliere il promotore che mostra un'espressione GFP coerente in tutta la cultura. Preparazione della libreria di shRNA del fattore epigenetico umano lentivirale aggregato. Coltura di cellule 293T a un basso numero di passaggio con un buon tasso di proliferazione in tre piatti di coltura cellulare da 10 centimetri con 8 ml di mezzo DMFM al 10% in ogni piastra.
Una volta che le cellule raggiungono il 60% di confluenza, sostituire completamente con un mezzo fresco. Preparare la miscela di trasfezione come delineato che contiene mezzo privo di siero, plasmide di imballaggio lentivirale PAX2, plasmide di involucro pMD2. G, plasmidi di libreria in pool e infine il reagente di trasfezione.
Toccare la miscela per mescolarla bene e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungere la miscela di trasfezione alle celle 293T e mescolare delicatamente facendo roteare le piastre. Incubare le piastre in un incubatore di anidride carbonica.
Cambiare il mezzo dopo 24 ore. Dopo 48 ore, controllare l'espressione della GFP al microscopio a fluorescenza per garantire un'elevata efficienza di trasfezione nelle cellule 293T. Raccogliere i supernatanti virali dopo 48, 60 e 72 ore e conservarli a 4 gradi e aggiungere un mezzo fresco, 8 ml, in ogni punto temporale dopo aver raccolto il virus.
Filtrare i virus raggruppati con un filtro da 0,4 micron. Per ottenere un titolo elevato di virus, concentrare i virus raggruppati mediante ultracentrifugazione. Trasferire i supernatanti virali filtrati in tubi da 70 Ti e centrifugare a 18.000 g per 2 ore.
Utilizzare rotore preraffreddato e centrifuga a 4 gradi. Estrarre accuratamente i tubi dalla centrifuga e rimuovere completamente il surnatante. Sospendere delicatamente il pellet in 400 microlitri di DMEM senza FBS e antibiotici usando una micropipetta, incubare sul ghiaccio per 1 ora.
Aliquota i virus e congelamento a meno 80 gradi. Calcola la concentrazione del virus come mostrato. Stima dell'efficienza di trasduzione dei lentivirus.
Trasdurre cellule 293T con un virus concentrato in diversi volumi, 2, 4 e 8, per confermare il successo della preparazione del lentivirus. Valore del virus concentrato a 100X per eseguire un esperimento di titolazione nella linea cellulare target. Semina 1 milione di linee cellulari bersaglio in 1,5 ml di mezzo 10% RPMI contenente 8 microgrammi per ml di polibrene in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Aggiungi quattro diversi volumi, 1, 1.5, 2, 2.5 microlitro di virus 100X. Eseguire la spinfection mediante centrifugazione della piastra a 920 g per 90 minuti a 37 gradi centigradi. Dopo 72 ore, misurare la percentuale di cellule GFP positive mediante citometria a flusso.
Determinare il volume dei virus per ottenere un'efficienza di trasduzione del 30%. Questa bassa efficienza di trasduzione serve a garantire l'integrazione di un singolo shRNA per cella. Trasduzione della libreria di shRNA epigenetici raggruppati nella linea cellulare resistente ai farmaci.
Calcola il numero di cellule da prelevare per l'esperimento come di seguito in base al numero di integranti virali. Risospesa 11 milioni di celle in 16 ML di supporto RPMI al 10%. Aggiungere il polibrene, otto microgrammi per ml e mescolare bene, quindi aggiungere il volume richiesto di virus per ottenere un'efficienza di trasduzione del 30% come calcolato in precedenza.
Semina tutte le cellule su una piastra a sei pozzetti ad una densità di 1 milione di cellule per 1,5 ml per pozzetto. Centrifugare la piastra per 90 minuti a 920 g a 37 gradi centigradi. Incubare la piastra durante la notte in un incubatore di anidride carbonica.
Dopo 24 ore, cambiare il mezzo e trasferire le cellule trasdotte in un pallone T-75. Dopo 48 ore, controllare la GFP al microscopio a fluorescenza per garantire una trasduzione di successo. Dopo 72 ore, quantificare la GFP mediante citometria a flusso.
Arricchimento delle cellule GFP positive. Espandere le cellule trasdotte coltivandole a una densità di 0,5 milioni per ml per 5-7 giorni ed eseguire lo smistamento del flusso con l'impostazione di selezione del flusso impostata come elevata purezza e bassa resa. Coltivare le cellule ordinate in un mezzo RPMI al 10%.
Dopo 72 ore, eseguire la stima post-ordinamento della percentuale di celle GFP positive per garantire un'efficienza di smistamento superiore al 95%. Screening dell'abbandono per identificare i fattori epigenetici che mediano la resistenza ai farmaci. Coltiva le cellule trasdotte dalla libreria shRNA in RPMI al 10% per un massimo di 5 giorni.
Centrifuga 10 milioni di celle in duplicati. Scartare il surnatante e conservare i pellet a meno 80 gradi. Questi campioni serviranno come riferimento di base per la libreria di shRNA epigenetici.
Coltiva le cellule trasdotte rimanenti come duplicati, R1 e R2, ciascuna mantenuta a un conteggio delle cellule che fornisce una rappresentazione 500X della libreria. Trattare uno dei duplicati con il farmaco, 10 citarabina micromolare e l'altro senza il trattamento farmacologico. Cambia il mezzo per i palloni con e senza il farmaco ogni 72 ore.
Ripetere il cambiamento medio tre volte per un'esposizione cumulativa al farmaco di 9 giorni. Dopo il 9 ° giorno di trattamento farmacologico, controllare la vitalità delle cellule con il metodo di esclusione del tripano blu. Girare verso il basso le cellule vitali rimanenti, lavare con PBS sterile e centrifugare a 280 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
Scartare il surnatante e conservare i pellet a meno 80 per l'estrazione del DNA. Amplificazione degli shRNA integrati mediante PCR. Estrarre il DNA dalle cellule basali trasdotte, cellule trattate e non trattate, seguito dal controllo della concentrazione utilizzando il fluorometro, calcolare la quantità di DNA richiesta come mostrato e sottoporre i campioni al primo ciclo di PCR.
La miscela di reazione PCR è rappresentata nella tabella 2 con le condizioni del ciclo termico. Impostare reazioni multiple contenenti 850 nanogrammi di DNA per tubo per un totale di 43 reazioni. Raggruppare i prodotti PCR e purificarli.
Eluire i prodotti in un tampone da 50 microlitri e quantificarli e, infine, conservare a meno 20. Per la PCR del secondo round, utilizzare primer a indice inverso e i reagenti sono tabulati nella tabella 4. Impostare quattro reazioni con 500 nanogrammi del prodotto PCR primario in un volume totale di reazione di 50 microlitro per ciascun campione insieme al controllo negativo.
Caricare l'intero prodotto per l'elettroforesi utilizzando gel di agarosio 2%TBE e confermare la dimensione della banda con una scala molecolare KB. Visualizza i prodotti PCR sul sistema di documentazione del gel. Asportare la fascia specifica e purificare utilizzando un kit di purificazione in gel.
I calcoli per la purificazione con il kit sono forniti nella tabella 3. Eluire in un volume finale di 30 microlitri di tampone di eluizione con la concentrazione approssimativa di ciascun eluente intorno a 80-90 nanogrammi per microlitro. Sequenziamento e analisi dei dati di nuova generazione.
I prodotti purificati in gel sono sottoposti a sequenziamento di nuova generazione per ottenere conteggi di lettura per le esigenze di shRNA impoverito. Tagliare le sequenze dell'adattatore, allineare le letture filtrate alle sequenze di riferimento, caricare i file utilizzando SAMtools per ottenere il riepilogo dell'allineamento. Carica i file fastQ tagliati in CRISPRCloud2 ed esegui l'analisi secondo le istruzioni.
Fare clic sul collegamento fornito per CRISPRCloud2. Seleziona il tipo di schermo come schermate Sopravvivenza e Dropout. Impostare il numero di gruppi e digitare il nome di ciascun gruppo.
Caricare la libreria di riferimento come formato di file FASTA. I dati caricati vengono elaborati e i risultati sono disponibili nell'URL specificato. Dati rappresentativi.
Questa figura mostra le cellule parentali e resistenti MV4-11 trattate con concentrazione crescente di citarabina, da 0,1 micromolare a 1.000 micromolari e la valutazione della vitalità mediante test MTT. Questa figura mostra i grafici di flusso rappresentativi della GFP quantificati mediante citometria a flusso alla fine di 72 ore per i promotori umani EF-1 alfa, CMV umano e SFFV. Il CMV umano mostra il nostro picco eterogeneo mentre l'EF-1 alfa e l'SFFV umani mostrano un singolo picco omogeneo.
Questa figura mostra il grafico a barre per le tre diverse efficienze del promotore in MV4-11. La GFP guidata da SFFV ha mostrato il silenziamento della GFP in una coltura prolungata. Le cellule GFP hEF-1 alfa-driven hanno mostrato un'espressione sostenuta dopo l'ordinamento di queste cellule.
Il pannello di sinistra mostra l'efficienza di trasfezione della libreria di shRNA raggruppata trasfetta in 293T alla fine di 48 ore al microscopio a fluorescenza. Il pannello di destra mostra l'efficienza di trasduzione del virus della piscina in 293T cellule con volumi di virus variabili, 2, 4 e 8 microlitri. Questa cifra rappresenta l'efficienza di trasduzione nella linea cellulare resistente a MV4-11 con volumi variabili di virus, come 1, 1,5, 2, 2,5 microliti per raggiungere un'efficienza di trasduzione del 30%.
Questa figura mostra lo smistamento delle celle GFP positive con efficienza di trasduzione del 30% con elevata purezza e impostazione di selezione a bassa resa. La figura mostra un'illustrazione schematica del trattamento farmacologico per le cellule selezionate GFP positive per un'esposizione prolungata alla citarabina di 9 giorni, seguita dal controllo della vitalità e dalla raccolta delle cellule per il DNA. Questa figura mostra le regioni di legame del primer utilizzate nel primo e nel secondo ciclo di PCR.
Questa figura illustra la dimensione della banda del prodotto PCR alla fine della PCR del primo round, 397 coppie di basi, e la seconda coppia di basi del prodotto PCR 399, che è stata eluita in gel, purificata e somministrata per NGS. Questa figura illustra la rappresentazione degli shRNA arricchiti o impoveriti che prendono di mira i fattori epigenetici che potrebbero mediare la resistenza alla citarabina nella LMA. Conclusione. Questo protocollo evidenzia l'importanza di uno screening mirato per interrogare sistematicamente geni essenziali e non essenziali e dimostra l'uso di questo approccio come piattaforma funzionale, consentendo l'identificazione di bersagli responsabili della resistenza ai farmaci.
