Questo protocollo ha dimostrato un metodo standardizzato per costruire tumori tridimensionali di sferoidi. E questa metodologia ha fornito un'analisi ad alto circuito e ad alto contenuto di costrutti tumorali 3D. Utilizzando un metodo standard di costruzione sferoidale tumorale e un sistema di imaging e analisi ad alto rendimento, l'efficacia e l'accuratezza dei test farmacologici formati su sferoidi tridimensionali possono essere notevolmente aumentate.
In questo protocollo, abbiamo usato AMG510 per trattare lo sferoide NCI-H23 come esempio. Dall'esperimento, abbiamo potuto osservare un effetto significativo del farmaco mirato canceroso sugli sferoidi tumorali. Per iniziare, pipettare 100 microlitri di reagente anti adesione in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con un fondo a forma di U e conservare per 10 minuti.
Dopo 10 minuti, aspirare il reagente di rivestimento e lavare due volte con PBS sterilizzato. Posizionare la piastra di coltura in un'incubatrice a 37 gradi Celsius in aria umidificata con il 5% di anidride carbonica fino all'uso. Osservare le cellule al microscopio.
Quindi, lavare le cellule coltivate in un pallone T25 due volte con PBS per rimuovere il terreno di coltura e trattare le cellule espanse con un millilitro di 0,25% tripsina EDTA per uno o due minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius, 5% anidride carbonica. Confermare la forma della cellula al microscopio. E poi interrompere il trattamento con tripsina aspirando la sospensione di tripsina EDTA usata nel pallone T25 e lavando le cellule con quattro millilitri di terreno fresco.
Trasferire tutta la sospensione in un tubo da 15 millilitri e utilizzare un millilitro di mezzo fresco per lavare le celle residue e aggiungerlo al tubo. Centrifugare le cellule a 186,48 G per cinque minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Aggiungere 10 millilitri di terreno fresco al pellet cellulare e pipettare delicatamente fino a quando le celle sono in una sospensione omogenea.
Aspirare 0,1 millilitri di sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga. Aggiungere 0,9 millilitri di terreno fresco e quindi pipettare bene la sospensione. Estrarre 10 microlitri della sospensione cellulare per il conteggio delle cellule.
Ripeti questo processo una o due volte e prendi un valore medio. Diluire la sospensione per raggiungere una densità di semina finale di 50.000 cellule per millilitro. Quindi, aggiungere 200 microlitri della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra inferiore a U a 48 pozzetti.
Avvolgere la pellicola sigillante attorno alla piastra e centrifugarla a 119,35 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, estrarre la pellicola protettiva e aggiungere da cinque a otto millilitri di acqua sterilizzata nel canale d'acqua che circonda i pozzi. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque giorni.
Non cambiare o integrare l'acqua nel canale d'acqua durante questo periodo e osservare l'aggregazione cellulare durante i cinque giorni successivi. Per l'incorporazione del gel, dopo aver estratto il gel congelato dal frigorifero a meno 20 gradi Celsius, posizionarlo su una ghiacciaia per tutto il tempo durante l'esperimento. Osservare gli sferoidi cellulari al microscopio.
Prima che inizi l'incorporazione del gel, è necessario controllare nuovamente lo stato degli sferoidi. Rimuovere con cautela 150 microlitri del mezzo e incorporare ogni sferoide nel gel aggiungendo lentamente il gel liquido dal lato della parete del pozzetto mentre si sposta la punta della pipetta pre-raffreddata intorno e all'interno del pozzetto. Attendere cinque minuti e se il gel non si diffonde uniformemente, pipettare delicatamente il gel con una punta di pipetta da 10 microlitri.
Ogni pozzetto contiene uno sferoide tumorale, 25 microlitri di 3,5 milligrammi per millilitro di gel e 50 microlitri di terreno di coltura completo. Aggiungi anche 75 microlitri di mezzo ai controlli. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti fino a quando l'idrogelazione è completamente completata.
Confermare lo stato di gelificazione al microscopio. Sovrapporre 125 microlitri di terreno fresco su ciascun campione e coltivare gli sferoidi per altri 7-10 giorni. Preparare gruppi di sferoidi con quattro o sei pozzetti ciascuno e sceglierne almeno tre per l'analisi.
Sciogliere il farmaco secondo le istruzioni del produttore e preparare soluzioni di lavoro 100 volte con DMSO. Utilizzare lo 0,1% di DMSO come controllo positivo e aggiungere 125 microlitri di terreno trattato con farmaci a ciascun pozzetto. Riposizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius in aria umidificata con il 5% di anidride carbonica.
In questa fase, ogni pozzetto contiene uno sferoide tumorale, 25 microlitri di gel da 3,5 milligrammi per millilitro e 175 microlitri del mezzo. I controlli contengono 200 microlitri del mezzo. Misurare la vitalità dello sferoide utilizzando un kit di analisi alamarBlue secondo le linee guida del produttore.
Aspirare 100 microlitri del mezzo surnatante da ciascun pozzetto a una nuova piastra di prova. Quindi, misurare la fattibilità utilizzando un fotometro a micropiastre. Misuralo il primo giorno, il quarto giorno, il settimo giorno e il giorno 10 dopo aver incorporato gli sferoidi nel gel.
Aggiungere 80 microlitri di terreno fresco a ciascun pozzetto della piastra di coltura. Quindi sostituire altri 100 microlitri del mezzo trattato con farmaco. Assicurati che non ci siano resti di alamarBlue nel pozzo.
Aspirare 100 microlitri del mezzo prima di visualizzare e posizionare la piastra sul palco. Ottieni immagini digitali degli sferoidi usando un microscopio automatico con un obiettivo decuplicato. Il microscopio può focalizzare e centralizzare automaticamente questi sferoidi.
Attendere l'imaging automatico. Per ogni sferoide vengono acquisite quattro immagini. Un'immagine integrata viene formata ed elaborata con il software collegato al sistema di imaging ad alto contenuto.
Fare clic sul pulsante di elaborazione della patch dell'immagine e scegliere le immagini integrate nel software. Scegli il modello U net e digita il tasso di conversione. Fare clic nella parte inferiore dello schermo per avviare l'elaborazione delle immagini.
Salva i dati relativi a diametro, perimetro e rugosità nel software del foglio di calcolo. Infine, aggiungere 100 microlitri di terreno fresco con il farmaco e riposizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius in aria umidificata con il 5% di anidride carbonica. Le immagini in campo chiaro degli sferoidi cellulari NCI-H23 trattati con diverse concentrazioni di AMG510 e catturati automaticamente da un microscopio ad alto contenuto sono mostrate in questa figura.
Le colonne rappresentano giorni diversi e le righe rappresentano diverse concentrazioni di farmaci. I risultati includono tre sferoidi per ogni condizione. La vitalità sferoidale tumorale dei gruppi campione trattati con AMG510 è stata misurata il primo, il quarto giorno, il settimo giorno e il giorno 10.
La vitalità cellulare terminale dei campioni con gradienti di concentrazione è mostrata in questa figura. I diametri sferoidi tumorali sono stati misurati il primo giorno, il quarto giorno, il settimo giorno e il giorno 10. Il rapporto di crescita sferoidale è stato definito come il volume terminale relativo al volume originale e calcolato utilizzando i diametri sferoidi.
Il rapporto di inibizione della crescita sferoidale è stato definito rispetto al volume e calcolato utilizzando i diametri sferoidi. La rugosità del tumore è stata misurata dal software il primo giorno, il quarto giorno, il settimo giorno e il giorno 10, indicando l'invasività degli sferoidi tumorali. Il perimetro dello sferoide è stato localizzato e disegnato dal software utilizzando algoritmi di deep learning.
Le aree sferoidi sul piano focale sono state quindi misurate dall'immagine J e un indice perimetrale in eccesso è stato calcolato sulla base di questi dati. Sebbene questo messaggio sia facile da seguire, i campioni devono ancora essere gestiti con attenzione.
