Il nostro protocollo consente ai ricercatori di sondare il metabolismo energetico mitocondriale e gli sferoidi senza soluzione di continuità per consentire confronti tra diverse linee cellulari, numeri di cellule e fenotipi, nonché trattamenti farmacologici in un campo di scoperta di farmaci e ricerca sul cancro. Il nostro lavoro presenta un protocollo dettagliato per esplorare il metabolismo energetico mitocondriale utilizzando sferoidi 3D che forniscono il modello fisiologico superiore rispetto agli esperimenti monostrato cellulare. Le osservazioni biologiche potrebbero estrapolare da uno sferoide vitreo a tumori in vivo e identificare percorsi che possono indirizzare il metabolismo del tumore sferoide.
Ad esempio, l'utilità dei carboidrati durante la crescita degli sferoidi. Tutti i dati seahorse extracellular flux 96 strumento è molto sensibile. Il posizionamento di sferoidi in vitro all'interno della piastra di dosaggio è fondamentale per ottenere dati accurati a livello di singolo sferoide.
Controllare la vitalità sferoidale utilizzando un microscopio a luce invertita con contrasto di fase con ingrandimento 4x per garantire la struttura sferoide intatta, la morfologia e l'uniformità generale tra i campioni. Per idratare la cartuccia del sensore, aliquotare circa 20 millilitri del calibrante in un tubo conico. Posizionare il tubo conico contenente il calibrante in un incubatore non di anidride carbonica a 37 gradi Celsius durante la notte.
Estrarre il contenuto del kit di analisi. Posizionare la cartuccia del sensore capovolta accanto alla piastra di utilità. Pipettare 200 microlitri di acqua sterile a doppio distillato in ogni pozzo della piastra di utilità utilizzando una pipetta P300 multicanale.
Posizionare la cartuccia del sensore sulla parte superiore della piastra di utilità. Controllare se il livello dell'acqua in ciascun pozzo è abbastanza alto da immergere le sonde del sensore. Trasferire la cartuccia del sensore assemblata in un incubatore non a 37 gradi Celsius di anidride carbonica e lasciarlo durante la notte.
Per rivestire la micropiastra di saggio sferoidale, aggiungere 30 microlitri di 0,1 milligrammi sterili per millilitro di soluzione di poli-D-lisina per pozzetto di micropiastra sferoide utilizzando una tecnica settica. Aspirare la soluzione da ciascun pozzetto della micropiastra sferoidale, invertire la piastra e picchiettarla saldamente sulla carta velina per rimuovere qualsiasi soluzione residua. Lavare ogni pozzetto della piastra con 200 microlitri di acqua sterile a doppia distillazione.
Dopo il lavaggio finale, capovolgere la micropiastra e picchiettarla saldamente sulla carta velina per rimuovere l'acqua residua. Lasciare asciugare la piastra all'aria per 30 minuti prima dell'uso futuro. Preparare il supporto RPMI XF come descritto nel manoscritto.
Prima del riscaldamento il mezzo di saggio XF RPMI integrato a 37 gradi Celsius un'ora prima del test. E prima del riscaldamento la micropiastra di analisi sferoide rivestita in un incubatore non di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Estrarre il tubo conico contenente il calibrante e la cartuccia del sensore dall'incubatore ad aria.
Rimuovere la cartuccia del sensore dalla piastra di utilità e posizionarla a testa in giù sul piano di lavoro. Utilizzando una pipetta multicanale P300, aspirare l'acqua dalla piastra di servizio e scartarla. Aggiungere 200 microlitri del calibrante preriscaldato a ciascun pozzetto della piastra di utilità.
Posizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità assicurandosi che i sensori siano ben immersi nel calibrante. Trasferire la cartuccia del sensore assemblata nell'incubatore non a 37 gradi Celsius fino a quando non è pronto per caricare le soluzioni di iniezione della porta. Estrarre la piastra di coltura sferoidale dall'incubatore e osservare gli sferoidi al microscopio per garantirne l'integrità prima delle fasi di trasferimento degli sferoidi.
Caricare 180 microlitri di mezzo di saggio prebellico in ciascun pozzetto della piastra sferoide, compresi eventuali pozzetti di correzione dello sfondo. Riempire parzialmente una capsula di Petri di sette centimetri con tre millilitri del mezzo di analisi. Trasferire gli sferoidi dalla piastra di coltura del pozzo 96 in una capsula di Petri, utilizzando una pipetta multicanale caricata con ampie punte di pipetta orifizio e volume impostato su 10-50 microlitri.
Impostare il volume di un pipettor a canale singolo dotato di un'ampia punta della pipetta dell'orifizio su 20 microlitri e aspirare accuratamente un singolo sferoide. Posizionare la punta direttamente al centro di ciascun pozzetto di questa micropiastra di analisi sferoidale e consentire l'azione capillare per prelevare lo sferoide dalla punta della pipetta. Confermare l'evoluzione al microscopio pipettando il contenuto del pipettatore nella capsula di Petri.
Una volta che tutti questi sferoidi sono stati trasferiti nella micropiastra di analisi sferoidale, trasferire la piastra in un incubatore non di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un minimo di un'ora. Preparare le concentrazioni di stock di lavoro di ciascun composto come descritto nel manoscritto, utilizzando un mezzo di saggio XF RPMI preriscaldato completamente integrato. Erogato 20 microlitri della soluzione di lavoro di ciascun composto in tutte le porte corrispondenti utilizzando una pipetta multicanale P100 calibrata.
Preparare l'analizzatore per il caricamento della cartuccia del sensore. Per ottenere sferoidi compatti ben formati, ogni linea cellulare è stata ottimizzata individualmente per la densità di semina e la durata della coltivazione. Con strategie di semina ottimizzate, il volume sferoidale per SK-OV-3 era di circa 5,46 x 10 ai sette micrometri cubetti e per A549, era di 1,45 x 10 a otto micrometri cubi.
Tutti i tipi di sferoidi avevano una correlazione lineare tra la densità iniziale di semina e il volume sferoide. La simmetria sferoide perfetta aveva una circolarità di 1,0 e una deviazione da 1,0 indicava una perdita di circolarità. Per tutti i tipi di sferoidi, il tasso di consumo di ossigeno è aumentato con le dimensioni dello sferoide ed è stato linearmente correlato al volume sferoide con il più alto negli sferoidi MCF-7 e il più basso negli sferoidi SK-OV-3.
Gli sferoidi MCF-7 non hanno risposto al controllo del veicolo durante l'esperimento. Il tasso di consumo di ossigeno negli sferoidi MCF-7 è stato abbassato con oligomicina dopo cinque cicli di misurazione in seguito alla prima iniezione di 0,5 microgrammi per millilitro. In risposta a BAM15, il tasso di consumo di ossigeno è aumentato prima della seconda iniezione.
Considerando che la combinazione di Rotenone più Antimicina A lo ha abbassato. Un protocollo per sondare accuratamente la respirazione mitocondriale basale. La respirazione di fosforilazione ADP, la respirazione a perdita, l'efficienza di accoppiamento, la capacità respiratoria massima e la capacità respiratoria di riserva sono state sviluppate utilizzando sferoidi 3D derivati dal cancro.
Tutti i composti respiratori hanno prodotto i profili di consumo cinetico di ossigeno attesi per i composti selezionati che rivelano un tasso medio di respirazione basale costante da 20 a 30 picomoli di ossigeno al minuto, per pozzetto. Posizione degli sferoidi all'interno della micropiastra e numero del ciclo di misurazione dopo l'iniezione del composto per garantire che i tassi di respirazione siano stabili tra le aggiunte di composti. Quando si esplora la capacità respiratoria mitocondriale con gli unbunplers, non solo la concentrazione è la chiave, ma anche la sua capacità di disaccoppiare la respirazione in presenza di oligomicina, che viene tipicamente aggiunta prima del disaccoppiatore negli esperimenti che sondano il metabolismo energetico mitocondriale.
