Gli espianti derivati dal paziente sono un metodo a breve termine che fornisce dati immediati sulla risposta al farmaco in grado di prevedere con precisione i risultati dei pazienti. Le piattaforme PD consentono di esaminare le risposte ai farmaci in un contesto 3D che rispecchia il più fedelmente possibile le caratteristiche patologiche e architettoniche dei tumori regionali. Gli espianti hanno il potenziale per offrire nuove informazioni sul metabolismo e sul meccanismo d'azione di un farmaco e per facilitare l'identificazione di nuovi biomarcatori farmacodinamici.
Prima di iniziare l'esperimento, pulire tutte le apparecchiature chirurgiche con una soluzione di alcolici metilati industriali al 70%. Riempi un piatto di coltura di 10 centimetri con 25 millilitri di terreno fresco su ghiaccio. Usando una pinzetta, trasferire il campione su una superficie di cera dentale E utilizzare due lame di innesto cutaneo per tagliare il tessuto in frammenti di circa due o tre millimetri cubi.
Trasferire gli espianti in un piatto di 10 centimetri e posizionare da sei a nove pezzi di tessuto in un tubo da un millilitro contenente il 10% di soluzione di formalina non tamponata per un'incubazione di 24 ore a temperatura ambiente. Riempire il numero desiderato di pozzetti di una piastra a sei pozzetti con 1,5 millilitri di mezzo fresco per pozzetto. E posizionare un piatto di inserto di coltura organotipica in ogni pozzetto in modo che galleggi sopra il mezzo.
Posizionare da sei a nove espianti su ciascun disco di inserimento e conservare per un'incubazione di 16 ore in un incubatore di anidride carbonica al 5% per consentire il recupero. Il giorno dopo, aggiungi mezzo fresco e farmaco a ciascun pozzetto di un nuovo piatto. Includere un pozzo per il controllo del veicolo.
Quando tutti i trattamenti farmacologici sono stati preparati, utilizzare una pinzetta per trasferire un inserto in ciascun pozzetto della nuova piastra a sei pozzetti per un'incubazione da 24 a 48 ore nell'incubatore di anidride carbonica. Dopo il trattamento farmacologico, trasferire i dischi in nuove piastre a sei pozzetti contenenti il 10% di formalina. E aggiungi qualche goccia di formalina al 10% nella parte superiore di ogni espianto per garantire una copertura completa con il fissativo per 24 ore di incubazione a temperatura ambiente.
Il giorno successivo, immergere un numero appropriato di piccole spugne istologiche in una soluzione metilata industriale al 70%. E posiziona le spugne all'interno di cassette istologiche. Quando tutte le spugne sono state posizionate, trasferire tutti gli espianti dalla stessa condizione di trattamento farmacologico su una singola spugna con il lato trattato con il farmaco di ciascun espianto che contatta il disco inserito.
Posizionare un'altra spugna presoalda sopra ogni espianto e chiudere la cassetta per fissare gli espianti nella cassetta. Quindi immergere le cassette in soluzione metilata industriale al 70% prima di procedere con l'elaborazione istologica. Dopo la scansione, eseguire un'analisi di addestramento e caricare le scansioni contenenti i timbri per l'addestramento nel software di analisi appropriato.
Nella visualizzazione a modalità singola, navigare tra le immagini e selezionare le scansioni da analizzare e la scansione con fluorescenza intrinseca. con la scansione a fluorescenza intrinseca su una singola vista, fare clic sul selettore di autofluorescenza per disegnare un segmento su un'area di tessuto non macchiato. Fare clic su Modifica marcatori e colori e immettere i nomi dei marcatori nella casella associata a ciascun fluoroforo.
Fare clic su Prepara immagini per consentire al software di sottrarre l'intensità della fluorescenza intrinseca da tutte le immagini caricate. Fare clic sul gradino del tessuto del segmento nella parte superiore dello schermo per aprire la finestra di allenamento della segmentazione del tessuto. Nel pannello delle categorie di tessuti, inserire il nome di ciascuna categoria di tessuto da segmentare.
Fare clic su Draw, per disegnare le regioni attorno a gruppi di cellule nella categoria di tessuto di interesse. Quindi passare alla categoria di tessuto successiva e disegnare nuove regioni. Quando tutte le regioni di addestramento sono state definite, utilizzare il segmentatore di tessuto del treno e attendere che l'accuratezza dell'allenamento si stabilizzi.
Possibilmente a un valore vicino al 100% Clicca sul segmento tutto per segmentare i tessuti. Dopo aver verificato la qualità della segmentazione tissutale, fare clic su Segmentazione cellulare e selezionare i compartimenti cellulari da segmentare. Per configurare il componente nucleare, utilizzare il tipico cursore di intensità per regolare la soglia utilizzata per rilevare i pixel nucleari.
Il feedback in tempo reale è fornito dalla finestra di anteprima. Per dividere i cluster di pixel nucleari, nel pannello di divisione dei componenti nucleari, selezionare il pulsante che meglio descrive la qualità di colorazione dei nuclei e utilizzare la barra di scorrimento per regolare la sensibilità di scissione. Quindi fare clic su Segmenta tutto per segmentare tutte le immagini.
Quando tutte le immagini sono state segmentate, nel pannello fenotipi, aggiungere l'elenco dei fenotipi da rilevare e inserire il nome dei fenotipi nella casella di testo corrispondente. Fare clic su modifica fenotipi per selezionare una particolare cella e selezionare il fenotipo corrispondente nel menu a discesa. Dopo aver completato la selezione per la formazione, fare clic sul classificatore del treno per valutare il risultato di ciascun fenotipo.
Procedere con il fenotipo tutto, salvare il progetto e fare clic su Esporta. Selezionare la scheda Analisi batch e caricare il progetto nell'algoritmo batch o nella casella del progetto. Per esportare le immagini e le tabelle, selezionare tutte le caselle nelle opzioni di esportazione, fare clic su Aggiungi diapositive e caricare tutte le immagini contenenti i timbri per i lotti precedentemente preparati.
Quindi fare clic su Esegui per avviare l'analisi batch di un timbro ed esportare i dati corrispondenti quando è stato acquisito. L'imaging multispettrale del tessuto di espianto NSCLC colorato per marcatori di vitalità cellulare, consente l'identificazione e la fenotipizzazione di singole popolazioni cellulari, nonché l'identificazione di componenti tumorali e stromali all'interno del microambiente tumorale di espianto. La segmentazione tissutale e cellulare delle macchie di marcatori di vitalità cellulare immagini multispettrali, come dimostrato, può essere utilizzata per quantificare la morte e la proliferazione cellulare in espianti derivati da pazienti trattati con farmaci di interesse.
Ad esempio, in questa analisi, in campioni di tessuto da tumori trattati con Nivolumab, è stato identificato un numero maggiore di cellule morenti rispetto ai campioni tumorali trattati di controllo. Inoltre, come illustrato, la capacità di estrarre informazioni spaziali da dissezioni colorate, consente il calcolo delle distanze intercellulari. Gli espianti possono anche essere utilizzati per un'ampia profilazione spaziale o citometria di massa, che consente di profilare centinaia di biomarcatori contemporaneamente a risoluzione sussidiaria preservando la struttura 3D del campione.
I PD potrebbero predire l'efficacia dell'immunoterapia. Ad esempio, potrebbe essere possibile distinguere i casi sensibili o resistenti agli inibitori del checkpoint immunitario e studiare i meccanismi alla base di questa distinzione.
