Questo protocollo descrive l'impianto ortotopico di cellule tumorali derivate dal paziente nella parete cieca di topi immunodeficienti. Questo modello ricapitola la malattia metastatica del cancro del colon-retto avanzato. Il modello di carcinoma colorettale ortotopico qui presentato ricapitola lo scenario clinico dei tumori intestinali avanzati e della malattia metastatica nei pazienti con carcinoma colorettale che non possono essere studiati utilizzando organoidi derivati da pazienti o modelli di xenotrapianto derivati da pazienti.
Da un topo sottoposto a eutanasia, estrarre il tumore rimuovendolo con cura dalla pelle e dal tessuto non tumorale circostante usando forbici e pinze. Posizionare i tumori raccolti in PBS a quattro gradi Celsius. Usando una lama, dissociare i tumori in una piastra di coltura di 10 centimetri contenente un millimetro di terreno.
Mettere il campione omogeneo dissociato in una provetta conica da 15 millilitri. Quindi, aggiungi il mezzo fino a un volume finale di cinque millilitri. Quindi, aggiungi il mezzo di digestione nel tubo.
Posizionare la provetta a 45 gradi all'interno di un incubatore per colture cellulari per un'ora a 37 gradi Celsius. Durante l'incubazione di un'ora, mescolare la soluzione ogni 15 minuti con una pipetta da cinque millilitri. Dopo l'incubazione, aggiungere cinque millilitri di terreno e mescolare bene.
Quindi, selezionare la soluzione con un filtro cellulare da 100 micrometri utilizzando una provetta sterile da 50 millilitri. Centrifugare le cellule selezionate a 500 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in tre millilitri di 1x soluzione tampone di lisi per globuli rossi.
Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere tre millilitri di terreno e mescolare il campione. Centrifugare a 500g per 10 minuti a temperatura ambiente e aspirare il surnatante.
Risospendere il pellet con 5-10 millilitri di terreno e utilizzare un contatore di cellule per calcolare il numero totale di cellule. Dopo aver centrifugato le cellule a 500g per 10 minuti a temperatura ambiente, risospendere in 10 millilitri di PBS. Ripetere la centrifugazione e lavare con 10 millilitri di PBS.
Risospendere il pellet per ottenere una concentrazione di 20 volte 10 alle sei cellule per millilitro e mescolare bene per ottenere una sospensione cellulare omogenea. Quindi, preparare una siringa da 29 g per l'iniezione del cieco. Caricare 50 microlitri di sospensione di cellule tumorali nella siringa e assicurarsi che non rimangano bolle d'aria nella siringa.
Mettere la siringa sul ghiaccio. Innanzitutto, sterilizzare il sito chirurgico spruzzando con detergente disinfettante e strofinando. Quindi, depilare l'addome usando una macchina per la depilazione del topo.
Posizionare il topo in posizione supina e disinfettare l'addome strofinando con clorexidina o iodopovidone. Fai un'incisione longitudinale di un centimetro sul basso ventre usando le forbici chirurgiche. Separare con cura la pelle ai lati per esporre il peritoneo.
Quindi, praticare un'incisione da 0,5 a un centimetro nella membrana peritoneo, sufficiente per esteriorizzare l'intestino cieco. Utilizzando una garza sterile pretagliata, isolare accuratamente il cieco dal topo. Inumidire il cieco è stata una soluzione salina durante tutta la procedura.
Immobilizzare il cieco tenendolo con cura con una pinza, quindi introdurre l'ago superficialmente nella parete del cieco. Lentamente, iniettare l'intero volume di 50 microlitri di sospensione di cellule tumorali. Questo processo richiede circa 10 secondi.
Dopo l'iniezione, rimuovere lentamente l'ago dal cieco e applicare una leggera pressione sul sito di iniezione con un applicatore con punta di cotone. Pulisci il cieco con una soluzione salina per rimuovere eventuali detriti e riporta il cieco nell'addome dell'animale. Chiudere il peritoneo con punti di sutura 5/0 e poi chiudere la pelle dell'addome con punti di sutura 5/0.
I tumori ortotopici CRC-PDX sono stati osservati nell'intestino di topi impiantati con cellule tumorali derivate da pazienti. L'analisi istologica mediante colorazione con ematossilina ed eosina sul cieco ha mostrato la presenza di cellule tumorali. L'analisi istologica ha anche rivelato metastasi polmonari e metastasi epatiche nei topi impiantati.
I topi portatori di tumori ortotopici sono stati trattati con il veicolo, il farmaco di prova o il farmaco chemioterapico irinotecan. L'analisi delle immagini di scansione micro CT ha mostrato che, rispetto al veicolo, il farmaco in esame ha indotto una riduzione del volume del tumore, che è stato ulteriormente ridotto in combinazione con il trattamento con irinotecan. Questo modello aiuterà a studiare la biologia delle metastasi nei tumori del cancro del colon-retto.
