La disfunzione dei mitocondri è associata a molte malattie, in particolare ai disturbi neurodegenerativi e metabolici. Pertanto, se riusciamo a capire come i mitocondri sono regolati dai lisosomi, aiuta a sviluppare nuove strategie terapeutiche. In questo protocollo, abbiamo dimostrato un metodo CLEM a due colori per visualizzare il contatto dei lisosomi mitocondriali.
La microscopia ottica ed elettronica correlativa è una tecnica di imaging che combina i vantaggi della microscopia ottica e della microscopia elettronica. In questo protocollo, massimizziamo il vantaggio di CLEM utilizzando sonde a doppio colore per visualizzare il contatto dei lisosomi mitocondriali. È difficile distinguere chiaramente i mitocondri che si degradano all'interno dei lisosomi utilizzando i tradizionali metodi di campionamento al microscopio elettronico.
Questo studio presenta il risultato CLEM ad alta risoluzione che ha mostrato chiaramente il dominio effettore dei lisosomi e dei mitocondri. Il metodo di prelievo a doppio colore è stato utilizzato per distinguere con precisione gli effettori dei mitocondri all'interno dei lisosomi. La nostra ricerca ha rivelato che i mitocondri interagiscono con i lisosomi.
La nostra ricerca ha rivelato che i mitocondri interagivano con i lisosomi in modi diversi in risposta a diversi stress esterni. Studiando le cause e i regolatori di questi fenomeni, otterremo informazioni sulla comprensione del controllo di qualità mitocondriale intracellulare. Per iniziare, coltiva le cellule HeLa a una densità di uno per 10 alla potenza di cinque in piastre di coltura con fondo a griglia di vetro da 35 millimetri.
Il giorno successivo, co-trasfettare le cellule al 30%-40% di confluenza con i plasmidi utilizzando il reagente di trasfezione. Dopo la trasfezione, trattare le cellule con dimetilsolfossido o U18666A e bafilomicina A1 per 18 ore. Per l'imaging confocale, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere immediatamente 250 microlitri di soluzione fissativa calda a 30-37 gradi Celsius.
Rimuovere immediatamente il fissativo. Sostituirlo con 1,5 millilitri di fissativo fresco e incubarlo con ghiaccio per 30 minuti. Quindi lavare le cellule tre volte per 10 minuti ciascuna con un millilitro di tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare ghiacciato.
Quindi, aggiungi un millilitro di soluzione fredda di glicina da 20 millimolari per spegnere l'aldeide. Dopo aver incubato le cellule su ghiaccio per 10 minuti, lavarle tre volte per 10 minuti ciascuna in tampone freddo di cacodilato di sodio molare da 0,1 molari. Quindi aggiungere 500 microlitri di soluzione rossa Amplex al piatto campione e incubare per cinque minuti con ghiaccio.
Successivamente, rimuovere la soluzione rossa di Amplex e sciacquare le cellule tre volte per 10 minuti ciascuna con tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare. Utilizzare un microscopio confocale per visualizzare l'area intorno alle cellule di interesse in modalità di scansione a tessere tre per tre. Acquisisci sia le interferenze, il contrasto differenziale che i segnali fluorescenti per identificare e registrare la griglia e le lettere sulla parabola utilizzando un obiettivo 40x.
Acquisire un'immagine delle cellule bersaglio ad alto ingrandimento utilizzando un obiettivo 40x e acquisire un'immagine Z-stack. Dopo aver analizzato le cellule colorate di rosso con Amplex utilizzando un microscopio confocale, aggiungere un millilitro di tetrossido di osmio ridotto all'1% a quattro gradi Celsius e incubare per un'ora. Quindi sciacquare il campione tre volte per 10 minuti ciascuna con acqua distillata a quattro gradi Celsius.
Disidratare in una serie di etanolo graduato per 15 minuti ogni volta a temperatura ambiente. Ora mescola l'etanolo con la resina epossidica in rapporti di volume di tre a uno, uno a uno e uno a tre, preparando un totale di 300 microlitri di ciascuna miscela. Versare ogni miscela di resina epossidica nel piatto e incubare a temperatura ambiente per un'ora.
Successivamente, preparare la capsula di inclusione riempiendola con resina epossidica fresca. Capovolgere il tubo o la capsula nella regione di interesse e metterla in forno a 60 gradi Celsius per 48 ore per polimerizzare. Quindi immergere il vetro inferiore e il blocco polimerico in azoto liquido per separarli.
Posizionare il blocco del campione nel portacampioni dell'ultra microtomo e posizionarlo nel blocco di rifilatura. Usa una lama di rasoio per tagliare la resina in una forma rettangolare o trapezoidale attorno all'oggetto di interesse. Posizionare il blocco del campione rifilato nel portacampioni e regolare la lama diamantata.
Utilizzando un ultra microtomo, tagliare sezioni ultrasottili a circa 60-70 nanometri dalle celle piatte incorporate. Raccogli le sezioni seriali su una griglia a fessura rivestita in formvar prima di asciugarle su una piastra calda. Successivamente, colorare le sezioni con una macchia di contrasto per due minuti e citrato di piombo per un minuto.
Quindi posizionare la griglia nel microscopio elettronico a trasmissione, o TEM, portacampioni per l'osservazione. Sulla base dell'immagine di contrasto interferenziale differenziale del microscopio ottico, identificare la cellula bersaglio di interesse e visualizzare l'intera area cellulare utilizzando immagini sovrapposte piastrellate con ingrandimento di 1, 700 volte Per ottenere la luce correlativa e le immagini al microscopio elettronico delle cellule HeLa utilizzando ImageJ Fiji, avviare ImageJ Fiji e fare clic su file, nuovo, TrakEM2 vuoto, e selezionare la cartella di archiviazione per creare un nuovo progetto TrakEM2. Trascinare i dati dell'immagine del riquadro non elaborati nell'area di lavoro per aprire il set di dati dell'immagine del riquadro.
Fare clic con il tasto destro del mouse e selezionare la linea, il montaggio di tutte le immagini in questo livello e le corrispondenze elastiche dei blocchi non lineari. Quindi fare clic su OK per accettare i valori predefiniti per i parametri rimanenti. Quindi, fai clic con il tasto destro del mouse e seleziona Esporta, seguito da Crea immagine piatta per creare un'immagine cucita.
Quindi fare clic su file e salva con nome per salvare l'immagine. Per ridimensionare l'immagine a fluorescenza, aprire il software di ingrandimento delle foto. Fare clic su file, aprire e selezionare l'immagine.
Immettere la larghezza e l'altezza. Per abbinare le dimensioni dell'immagine del microscopio elettronico. Selezionare l'algoritmo da applicare nel metodo di ridimensionamento.
Fare clic su file e salva con nome per salvare l'immagine ridimensionata. Apri ImageJ Fiji e trascina e rilascia la fluorescenza ridimensionata e la micrografia elettronica unita nell'area di lavoro. Fare clic su plug-in, visualizzatore di big data e big warp per avviare la registrazione.
Quindi fare clic sul menu a discesa per selezionare l'immagine del micrografo a fluorescenza come immagine in movimento e l'immagine del micrografo elettronico come immagine di destinazione. Utilizzando funzioni come lo zoom, la rotazione e lo spostamento dell'immagine, è possibile confrontare le immagini della fluorescenza e della micrografia elettronica. Premi la barra spaziatrice sulla tastiera per passare alla modalità punto di riferimento e premi il pulsante sinistro del mouse per contrassegnare almeno tre punti di riferimento identificati in entrambe le immagini.
Dopo aver contrassegnato tutti i punti di riferimento identificati, vai su file, esporta l'immagine in movimento e fai clic su OK. Apparirà una nuova finestra pop-up con l'immagine del micrografo a fluorescenza trasformato. Fare clic su file e salvare con nome per salvare l'immagine della micrografia a fluorescenza trasformata.
Per sovrapporre le immagini CLEM, trascinare e rilasciare l'immagine del micrografo a fluorescenza trasformato e l'immagine del micrografo elettronico unito nell'area di lavoro ImageJ. Fare clic su immagine, tipo e colore a otto bit. Per impostare lo stesso tipo di immagine sia per le immagini a fluorescenza che per quelle al microscopio elettronico.
Fare clic su immagine, colore e canali di unione. Per combinare le immagini. Fare clic su file e salvare con nome per salvare l'immagine CLEM.
I mitocondri intrappolati all'interno dei lisosomi sono stati osservati nelle cellule trattate con bafilomicina A1, indicando un'autofagia inibita e una riduzione della qualità mitocondriale, mentre le cellule di controllo hanno mostrato che i mitocondri interagivano con i lisosomi ma non erano inghiottiti dai lisosomi, mentre le cellule di controllo mostravano che i mitocondri circondavano i lisosomi piuttosto che essere inghiottiti da essi. Le cellule trattate con U18666A hanno mostrato un aumento delle interazioni tra mitocondri e lisosomi, con alcuni lisosomi inghiottiti dai mitocondri.
