Il nostro protocollo è il primo che consente la misurazione dinamica del liquido superficiale delle vie aeree, o pH ASL, in tempo reale sia sotto il riposo che dopo il trattamento agonista o inibitore. Questo metodo aiuta a identificare i canali ionici e i trasportatori coinvolti nella regolazione extracellulare del pH e potrebbe essere applicato ad altri sistemi cellulari in cui questo è importante, come il cancro. Ora rispetto ai metodi pubblicati in precedenza, questa nuova tecnica è relativamente semplice da eseguire.
Non richiede attrezzature specializzate. E può effettuare misurazioni del pH ASL contemporaneamente in più colture sotto interfaccia liquido ad aria o in condizioni di film sottile. È importante sottolineare che questa nuova tecnica ha il potenziale per valutare gli effetti di nuove terapie, non solo per la fibrosi cistica, ma anche per altre malattie croniche delle vie aeree, come l'asma e la BPCO.
Dopo almeno 28 giorni di coltura, lavare la superficie apicale di una coltura cellulare epiteliale delle vie aeree umane con 150 microlitri di bicarbonato contenenti soluzione tampone Krebs per 20 minuti sull'incubatore di coltura cellulare. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta di vetro sterile con una punta sterile di pipetta P200 collegata a una pompa di aspirazione, per aspirare attentamente il lavaggio senza interrompere l'epitelio. Sulla superficie apicica dovrebbe rimanere il meno liquido possibile per ripristinare l'interfaccia del liquido d'aria.
Quindi riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 30 minuti. Per eseguire una misurazione in background, accendere il lettore di lastre e il computer. Dopo aver aperto il cruscotto, fare clic su Spark 10M e impostare il controllo della temperatura su 37 gradi Celsius.
Quindi aprire il controllo del gas e impostare l'anidride carbonica al 5%Quando la temperatura e il gas hanno raggiunto i loro obiettivi, aprire il cassetto del lettore di lastre e inserire nel lettore una cassetta di umidità piena di sei millilitri di acqua distillata su ciascun lato. Verificare che il coperchio e il fondo della piastra di coltura cellulare siano puliti e posizionare la piastra sulla cassetta di umidità, rimettere il coperchio e chiudere il cassetto. Aprire l'editor del metodo Spark, selezionare il modello di piastra appropriato e selezionare i pozzi da monitorare durante l'esperimento.
Aggiungere un pannello di controllo della temperatura e dell'anidride carbonica e impostare i pannelli rispettivamente a 37 gradi Celsius e 5%. Quindi spunta l'attesa per le scatole di temperatura / gas. Aggiungete un pannello loop cinetico e selezionate la durata come tipo di loop.
Impostare la durata su cinque minuti e impostare il tipo di intervallo dell'esperimento su non definito, per ottenere una lettura continua. All'interno del ciclo cinetico, utilizzare la funzione drag and drop per aggiungere due pannelli di intensità di fluorescenza che verranno impostati individualmente per i coloranti fluorescenti sensibili al pH e al pH. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente a 560 e 590 nanometri per il colorante sensibile al pH.
E rispettivamente 495 e 520 nanometri per il colorante insensibile al pH. Impostare il numero di flash su 30 e la posizione z su 33.200 per ogni fluoroforo. Impostare la lettura multipla per pozzo sull'utente definito, come un tre per tre per cerchio con un bordo di 4.750 micrometri.
Fare clic sul pulsante start per avviare la lettura della misurazione dello sfondo e scegliere ok, per verificare che il coperchio della cassetta di umidità sia in posizione. Al termine della misurazione, trasferire la piastra dal lettore di lastre a un armadio di sicurezza per la coltura tissutale e aggiungere tre microlitri di soluzione di colorante fluorescente accoppiata a dextran appena preparata alla superficie apicale delle cellule. Quindi riportare il piatto all'incubatore di coltura cellulare durante la notte.
Per la misurazione cinetica, aprire il file di metodo utilizzato per le misurazioni di fondo. Una volta impostati tutti i parametri, aprire il cassetto del lettore di lastre e inserire la cassetta di umidità. Posizionare la piastra pulita nella cassetta di umidità con il coperchio e fare clic su avvia per avviare le letture di fluorescenza.
Quindi fare clic su OK, per confermare che il coperchio della cassetta di umidità è in posizione. Dopo un minimo di 12 cicli, fare clic su pausa per interrompere l'esperimento e rimuovere la piastra per applicare basolateralmente eventuali farmaci o agonisti ai campioni appropriati. Riportare la piastra alla cassetta di umidità sul vassoio e riposizionare il coperchio della cassetta di umidità, prima di fare clic continuare, per registrare ulteriormente il pH ASL e monitorare l'effetto del trattamento.
Per la calibrazione del pH in situ, rimuovere la piastra dal lettore di lastre e aspirare la soluzione basolaterale. Aggiungere 750 microlitri di soluzione curva standard altamente tamponata al compartimento basolaterale e un microlitro di soluzione alla superficie apicali. Spegnere l'anidride carbonica sul lettore di lastre e riportare la piastra alla cassetta di umidità.
Quindi impostare il lettore di lastre con gli stessi parametri dimostrati, ma senza anidride carbonica, e iniziare le letture della fluorescenza ogni cinque minuti per una o una ora e mezza. Per l'analisi dei dati, selezionare tutti i dati meschino per ogni campione e, o condizione per entrambe le lunghezze d'onda nel file di sfondo, copiare e incollare i dati in un nuovo file. Quindi calcola lo sfondo medio per ogni pozzo e ogni lunghezza d'onda.
Dopo aver copiato e incollato i dati di calibrazione e cinetici nello stesso modo, sottrarre lo sfondo da ogni punto dati per ogni lunghezza d'onda. Per ogni punto di tempo e ogni campione, calcolare il rapporto tra la fluorescenza sensibile al pH e la fluorescenza insensibile al pH. Per ogni punto di tempo, generate una curva standard dai rapporti e tracciate i valori di pH noti sull'asse x e i rapporti sull'asse y.
Determinare il punto di tempo in cui i rapporti sono stabili, adattarsi a una linea di regressione lineare e ottenere l'equazione per questa linea. Quindi, calcola il pH per ogni punto di tempo e traccia il pH sull'asse y e il tempo sull'asse x. In questo esperimento preliminare rappresentativo senza cellule con lo stesso pH e la stessa concentrazione, i rapporti di emissione sensibili al pH e insensibili al pH differivano a seconda del volume del colorante.
Inoltre, allo stesso pH e allo stesso volume, diverse concentrazioni di coloranti hanno fornito valori di rapporto diversi, indicando che le variazioni del volume o della concentrazione del colorante influenzano il valore assoluto del pH calcolato dal rapporto di emissione. Inoltre, il tempo necessario per l'equilibrazione della temperatura è di circa 15-20 minuti indipendentemente dal volume o dalla concentrazione del colorante. I valori di pH ASL ottenuti da un'unica curva standard globale dimostrano una differenza significativa tra le colture di fibrosi non cistica e fibrosi cistica.
Mentre, il pH ASL non è significativamente diverso tra fibrosi cistica e fibrosi non cistica cellule epiteliali delle vie aeree umane quando il pH è calcolato da curve standard indipendenti. Pertanto, è importante generare curve di calibrazione indipendenti per ogni esperimento e all'interno di ogni esperimento, per ogni campione donatore, come quando le curve di calibrazione sono medie insieme, valori di rapporto più alti sensibili al pH e insensibili al pH si trovano nelle colture di fibrosi cistica che indicano un pH più acido. Come previsto, l'aggiunta di forskolina basolaterale aumenta significativamente il pH ASL solo nelle colture di fibrosi non cistica.
Poiché queste cellule sono state tenute in condizioni sterili, possono essere lavate, re-nutrite e utilizzate pochi giorni dopo per esperimenti futuri. Tutti gli esemplari biologici umani devono essere considerati potenzialmente pericolosi. Quindi assicurati di utilizzare il livello appropriato di confinamento e dispositivi di protezione individuale a seconda dei campioni.
È importante eseguire le misurazioni dello sfondo e le calibrazioni del pH per ogni set di campioni al fine di ridurre la variabilità tra donatori e migliorare l'accuratezza.
