The authors are financially supported by the Swiss National Science Foundation through an operating grant N&#176; 31003A-149566 (to N.D.), and The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust through a Young Investigator Subsidy (to P.N.).

Etica Dichiarazione: Tutte le manipolazioni sugli animali sono state eseguite in stretta conformità con le linee guida del Comitato delle Università di Ginevra Animal Research. 1. Preparazione di obiettivi fagocitiche <ol><li> Aggiungere 20 mg di zimosan essiccata a 10 ml di fosfato sterile salina tamponata (PBS). Vortex e calore in un bagno di acqua bollente per 10 min. Raffreddare e centrifugare a 2000 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, risospendere in 1 ml di PBS e ultrasuoni per 10 minuti in un bagno sonicatore acqua. Trasferire 500 microlitri di due provette da 1,5 ml. Centrifugare a 11.000 g per 5 min. </li><li> Ripetere il lavaggio con 500 microlitri di PBS. Il zymosan bollito può essere aliquotato, congelato e conservato a -20 ° C. </li><li> Lavare zymosan due volte in 500 microlitri preparate 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 come sopra (punto 1.2). </li><li> Risospendere in 490 microlitri dopo il lavaggio finale. Aggiungere 10 ml di 10 mg / ml FITC sciolto in dimetil sulfoxide (DMSO), vortice, coprire con un foglio, e incubare con agitazione per 4 ore a temperatura ambiente. </li><li> Per rimuovere il colorante, lavare come in precedenza (punto 1.2), prima con 0,5 ml di DMSO + 150 l di PBS, poi 0,5 ml di DMSO + 300 ml di PBS, poi 0,5 ml di DMSO + 450 l di PBS, poi PBS da solo. </li><li> Conte zymosan utilizzando un emocitometro. Aggiungere 1 ml di zymosan a 500 microlitri di PBS, vortex, quindi aggiungere 10 microlitri al bordo della camera dell&#39;emocitometro, dove incontra il coprioggetto posto sopra la griglia centrale. Montare il emocitometro su un microscopio in campo chiaro equipaggiato con un obiettivo 20X. </li><li> Focus su nell&#39;angolo in alto a sinistra contenente 16 piazze e contare tutte le particelle zymosan in questo settore con un contatore riscontro mano. Ripetere con l&#39;angolo in basso a destra. Calcolare la concentrazione zymosan utilizzando la seguente equazione: concentrazione Zymosan = Count / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml. Zymosan etichettati, possono essere aliquotato, congelato e conservato a -20 ° C. </li><li> Opsonize l&#39;etichetta wi zymosanTh A anticorpo anti-coniglio di zymosan a diluizione 1: 100. Vortex e incubare per 1 ora in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Lavare con 500 microlitri di PBS come sopra (punto 1.2). Nota: Sonicazione è altamente raccomandato, in particolare dopo opsonizzazione, come zymosan tende a formare grumi che possono rendere l&#39;analisi più difficile in seguito. Opsonizzazione con il 65% v / v di ratto o siero umano può essere utilizzato in alternativa. </li><li> Conte zymosan utilizzando un emocitometro come descritto nei passaggi 1,7-1,8, e portare a 100 x 10 6 particelle / ml. Opsonizzazione con altri stimolatori fagocitosi, come complemento o no opsonizzazione, può essere effettuata in alternativa. </li></ol> 2. Live Video Microscopia <ol><li> Isolare neutrofili principale del mouse come descritto in dettaglio altrove 38. <ol><li> In alternativa, utilizzare qualsiasi tipo di cellula fagocitica. Mantenere neutrofili sul ghiaccio in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 5% di siero fetale bovino (v / v), penicillina 200 U / streptomycin, ad una concentrazione di 10 x 10 6 cellule / ml fino al momento dell&#39;uso. Altri tipi di cellule possono essere seminate 1-4 giorni prima. </li></ol></li><li> Aggiungere 2 x 10 5 (20 ml) di neutrofili al centro di un piatto fondo di vetro 35 mm, diffondere il calo aggiungendo 50 ml di terreno ed incubare a 37 ° C per 5 minuti per consentire cellule di aderire. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) riscaldato a 37 ° C che contiene la specifica MPO idrazide inibitore 4-aminobenzoico (4-ABH, 10 micron). Non specifici inibitori MPO, come il sodio azide (5 mm), possono anche essere utilizzati, ma sono state recentemente suggerito di esercitare ulteriori effetti non specifici sul pH 39. </li><li> Montare il piatto su un microscopio a fluorescenza widefield dotato di un sistema di riscaldamento 37 ° C e un obiettivo 40X olio. Incubare le cellule senza l&#39;imaging per 10 minuti per consentire alle cellule e attrezzature equilibrare. </li><li> Regolare le impostazioni del microscopio per acquisire un&#39;immagine di trasmissione in campo chiaro [phase o il contrasto di interferenza differenziale (DIC), se disponibile] con 440 nm o 490 nm di eccitazione e 535 nm di emissione ogni 30 sec. </li><li> Regolare il tempo di esposizione e la frequenza di acquisizione secondo il sistema microscopio per evitare troppo photobleaching e fototossicità e seconda delle domande sperimentali viene chiesto. Inizia l&#39;acquisizione delle immagini. </li><li> Dopo 2 min, aggiungere 10 x 10 6 (50 microlitri) opsonizzati FITC-zymosan al centro del piatto. Regolare bersaglio: i rapporti di cellule a seconda del tipo di fagociti e target utilizzato. </li><li> Continuare di imaging per 30 min. Dopo 30 minuti fermare l&#39;acquisizione time-lapse e avviare un timer. Spostare lo stadio e catturare più di 10 istantanee in diversi campi di vista di immagine altri fagosomi, tutti a 5 minuti. </li></ol> 3. taratura e controllo Esperimenti <ol><li> Preparare le soluzioni di taratura pH (ricette sono descritti nella Tabella 1) prima del giorno di esperimento e congelare in 10 ml aliquote.Scongelare le soluzioni di taratura e la calda a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. Controllare il pH con un pHmetro e registrare il pH effettivo di soluzioni. </li><li> Montare una pompa peristaltica sul fondo piatto di vetro prima acquisizione dell&#39;immagine ed eseguire la microscopia video dal vivo come descritto sopra (sezione 2). </li><li> Alla fine del periodo di acquisizione 30 min accendere la pompa per rimuovere la soluzione all&#39;interno del piatto, aggiungere 1 ml della prima soluzione di calibrazione e arrestare la pompa. </li><li> Attendere che il segnale si stabilizza, di solito 5 min. Ripetere con ogni soluzione di calibrazione. <ol><li> Effettuare almeno una calibrazione al giorno sperimentale, e calibrare iniziando con il più alto pH e sequenzialmente lavorare al minimo, così come a partire dal pH basso e lavorando in sequenza verso l&#39;alto. </li></ol></li><li> Come controllo, aggiungere 100 ml di 100 mM inibitore NADPH ossidasi difenil propionium ioduro (DPI) diluiti in HBSS alle cellule in 900 microlitri HBSS nel piatto fondo di vetro, eincubare per 10 min. </li><li> Avviare l&#39;acquisizione e aggiungere zymosan come sopra (punto 2.7). Dopo 15 min di fagocitosi, aggiungere 10 ml di 10 mM inibitore V-ATPasi concanamycin A (ConcA) diluiti in HBSS e continuare l&#39;imaging per altri 15 min. </li></ol> 4. Analisi <ol><li> L&#39;analisi dei filmati time-lapse e istantanee phagosome. Nota: Le seguenti istruzioni sono specifici per ImageJ. Step-by-passo le istruzioni possono variare ampiamente a seconda del software utilizzato, ma le funzioni descritte in questa sezione sono disponibili nella maggior parte dei software di analisi immagine professionale. <ol><li> Aprire le immagini con il software di analisi di immagine professionale. Sottrarre il fondo nel canale 490 tracciando una piccola ROI piazza con lo strumento di selezione del poligono piazza in una zona dove non ci sono le cellule, e facendo clic su Plugins&gt; BG Sottrazione di ROI. Poi caricare lo stesso ROI sul canale 440 facendo clic su Modifica&gt; Selezione&gt; Ripristina selezione e ripetere. </li><li>Fare un rapporto di immagine a 32 bit del canale 490 diviso per il canale 440 cliccando processo&gt; Calcolatrice Immagine ..., selezionando le immagini appropriate nei menu a scorrimento visualizzati Image1 e Image2, quindi selezionando &#39;Divide&#39; nel menu a discesa Operazione , e controllando il risultato casella di controllo a 32 bit (float). </li><li> Cambia il look-up table colori per una codifica a colori compatibile rapporto facendo clic su Immagine&gt; tabelle di ricerca&gt; Arcobaleno RGB. Soglia l&#39;immagine rapporto di eliminare 0 e infinito pixel facendo clic su Immagine&gt; Regola&gt; Soglia .... Regolare le barre di scorrimento in modo che zymosan appare in rosso e fare clic su Applica, assicurandosi che i pixel dello sfondo Imposta la casella di controllo per NaN è selezionata. </li><li> Combinate questo rapporto stack con il canale in campo chiaro in un composito multi-canale cliccando Immagine&gt; Colore&gt; Unisci canali, e selezionando l&#39;immagine in campo chiaro nel menu a discesa dei canali grigio e l&#39;immagine il rapporto nel menu a discesa canale verde, e selezionando laMantenere immagini di origine check-box. Scansione film time-lapse o istantanee per determinare quale phagosomes devono essere analizzati. Il canale in campo chiaro è utile per questo. </li><li> Disegna regioni di interesse (ROI) utilizzando lo strumento di selezione ovale poligono attorno fagosomi, e aggiungerli al gestore ROI facendo clic su Analizza&gt; Strumenti&gt; ROI Manager&gt; Aggiungi. Misurare il loro rapporto di intensità zymosan facendo clic su Altro&gt; multimisura e de-selezionando l&#39;Una riga per fetta casella di controllo. </li><li> Per i filmati time-lapse, pista phagosomes uno alla volta disegnando un ROI, digitando CTRL + M per misurare ogni punto di tempo, e spostando il ROI in caso di necessità di monitorare i valori di intensità nel corso del tempo. Copiare le misurazioni dalla finestra Risultati in un foglio elettronico. Nota: Analisi di 15 (5 andamenti temporali per esperimento x 3) esperimenti indipendenti è ideale, ma più o meno può essere richiesta a seconda della variabilità osservata. Salvataggio delle ROI è sempre consigliato. Alcuni pacchetti software consentono regi immaginestrazione e aggiornamento dinamico di ROI, facilitare questo parte dell&#39;analisi. </li></ol></li><li> La conversione da fluorescenza a valori di pH <ol><li> Misurare il rapporto 490/440 per phagosomes nella calibrazione film time-lapse, come descritto nella sezione 4.1. </li><li> In un foglio di calcolo, tracciare i valori del rapporto nel corso del tempo, e calcolare i valori medi del rapporto da tutti i fagosomi all&#39;interno del campo di vista (di solito, tra 5-20) da 5 punti temporali entro la metà del periodo di tempo corrispondente ad ogni calibrazione pH soluzione. (Vedi anche le caselle rosse nella figura 5A.) </li><li> Tracciare questi medi 490/440 valori del rapporto contro il pH attuale di misura. Combina almeno 3 tarature indipendenti in un unico grafico. Utilizzare un pacchetto software statistico o numerico per eseguire una regressione lineare (migliore misura della curva), di solito per una equazione sigmoidale. Nota: per esempio, nella Figura 5B l&#39;equazione utilizzata era un sigmoidale Boltzmann [Y = inferiore + ((Alto-Basso)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], dove i valori di Y sono i rapporti 490/440, X sono i valori di pH e alto, in basso, i parametri V50 e pendenza sono calcolati dal software. </li><li> Usare l&#39;equazione ottenuto di trasformare valori di rapporto al pH. Nota: Per esempio, nella Figura 5B nell&#39;equazione ottenuto per la curva di calibrazione in presenza di sodio azide è 490/440 Ratio = 1.103 + [(2.89-1.103) / (1 ​​+ EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . Risolvendo per pH dà la seguente equazione: pH = 6.993 - 0,9291 * [LN ((1.178 / (Ratio-1.103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosomal+proteolysis+in+dendritic+cells+is+modulated+by+NADPH+oxidase+in+a+pH-independent+manner.">Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner.</a> EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).</li><li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells.">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).</li><li>Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Interferon-inducible+lysosomal+thiol+reductase+(GILT)+maintains+phagosomal+proteolysis+in+alternatively+activated+macrophages.">gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages.</a> J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).</li><li>Sanjurjo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scavenger+protein+apoptosis+inhibitor+of+macrophages+(AIM)+potentiates+the+antimicrobial+response+against+Mycobacterium+tuberculosis+by+enhancing+autophagy.">The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy.</a> PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).</li><li>Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utility+of+Chloroquine+in+Cancer+Therapy.">The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy.</a> Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).</li><li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents.">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li><li>El Chemaly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSOP/Hv1+proton+channels+sustain+calcium+entry,+neutrophil+migration,+and+superoxide+production+by+limiting+cell+depolarization+and+acidification.">VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification.</a> J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).</li><li>Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HVCN1+channel+conducts+protons+into+the+phagocytic+vacuole+of+neutrophils+to+produce+a+physiologically+alkaline+pH.">The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH.</a> bioRxiv. , (2014).</li><li>Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+regulation+of+the+cellular+responses+to+cold+shock:+the+responses+in+yeast+and+mammalian+systems.">Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems.</a> Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).</li><li>Yui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+targeting+and+microtubule-dependent+transcytosis+of+the+aquaporin-2+water+channel.">Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).</li><li>Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+phagosome+individuality+and+membrane+signalling+networks.">On phagosome individuality and membrane signalling networks.</a> Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).</li><li>Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+mitochondrial+proton+gradient+during+cytosolic+calcium+elevations.">Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations.</a> J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Sebbene più tempo rispetto metodi alternativi, come la spettroscopia e FACS, che impiegano una simile strategia di utilizzo di un colorante sensibile al pH accoppiato obiettivi ma misurano il pH medio di una popolazione di fagosomi, microscopia offre diversi vantaggi. Prima è che interno ed esterno vincolati, ma non interiorizzato, le particelle possono essere facilmente distinguibili, senza dover aggiungere altre sostanze chimiche, come trypan blu o di anticorpi, per placare o etichettare particelle esterne, rispetti...

Phagocytosis, the process through which innate immune cells engulf large particles, evolved from the eating mechanism of single-celled organisms, and involves binding to a target, enveloping it with a membrane and pinching the membrane off to form a vacuole within the cytosol called a phagosome. While the phagosomal membrane is derived from the plasma membrane, active protein and lipid sorting, as well as fusion with endomembranes during phagosome formation, transform the phagosome into a distinct organelle within the cell with degradative properties that allow the killing, neutralization and breakdown of the ingested material1-3. This process, called phagosomal maturation, relies on the delivery of a host of proteolytic and microbicidal enzymes, including the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase which transfers electrons into phagosomes producing the strong oxidant O2- and its derivative reactive oxygen species (ROS) 2,4. 
The luminal pH of phagosomes has a profound influence on several events required for phagosome function. First, pH influences trafficking of endomembranes in general, as pH-dependent conformational changes of transmembrane trafficking regulators alters the recruitment of trafficking determinants such as Arfs, Rabs and vesicular coat-proteins, which in turn define which vesicles may fuse with phagosomes 5-8. Second, the ionic composition of the phagosomal lumen is also transformed as phagosomes mature, and some ion transporters, such as the Na+/H+ exchanger or ClC family Cl-/H+ antiporters, which promote phagocytic function, rely on H+ translocation 9,10. Similarly, ROS production is intimately linked with phagosomal pH. ROS and its toxic oxidant byproducts have long been recognized as crucial for phagosomal killing in neutrophils 4,11,12, and have been shown to play critical roles in other phagocytes including macrophages, dendritic cells (DCs) and amoeba 13-16. The NADPH oxidase is an electrogenic enzyme that releases H+ in the cytosol as NADPH is consumed, and that requires the simultaneous transfer of H+ through companion HVCN1 channels alongside the transported electrons into the phagosomal lumen, in order to alleviate the massive depolarization that would otherwise lead to self-inhibition of the enzyme 17-21. Finally, several proteolytic enzymes have optimal activity at different pH, so time-dependent phagosomal pH changes can influence which enzymes are active and when. The importance of phagosomal pH is highlighted by organisms such as Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis and Salmonella typherium that subvert phagocytic killing at least in part by altering phagosomal pH 22-24.
In mammals the main phagocytes are neutrophils, macrophages and dendritic cells, and depending on cell type, time-dependent phagosomal pH changes can vary widely, and appear to play different roles. In macrophages a strong and rapid acidification mediated by the ATP-dependent proton pump vacuolar ATPase (V-ATPase) is one of the key factors mediating killing 25-27, resembling the mechanisms present in amoeba that use phagocytosis as an eating mechanism 28. In these cells activation of acidic proteases is thought to play a key role. In contrast, neutrophil killing relies more on ROS as well as HOCl produced by myeloperoxidase (MPO)11, and the pH remains neutral or alkaline during the first 30 min acidifying only later 29,30. Neutral pH has been suggested to favor the activity of oxidative proteases such as certain cathepsins. In DCs phagosomal pH is controversial, with some reporting acidification and others neutral or alkaline pH 31,32, but ROS and pH may profoundly influence the ability of these cells to present antigens to T cells, one of their main functions 33. 
Importantly, hormones, chemokines and cytokines may produce signaling events that induce maturation and changes in phagocyte behavior, and in turn influence phagosomal pH 34,35. Similarly, drugs, for example the antimalarial chloroquine, which is also considered for anti-cancer therapies 36, may affect phagosomal pH and therefore immune outcomes. Thus, a variety of cell biologists, immunologists, microbiologists and drug developers may be interested in measuring phagosomal pH when seeking to understand the mechanisms underlying the effects of a particular genetic disruption, bioactive compound or microorganism on innate and adaptive immune responses. 
Here we describe a method for measuring phagosomal pH in neutrophils that allowed us to show the importance of the HVCN1 channel in regulating neutrophil phagosomal pH 19. The method is based on the ratiometric property of fluorescein isothiocyanate (FITC) whose fluorescence emission at 535 nm is pH sensitive when excited at 490 nm but not 440 nm 37. When this dye is chemically coupled to a target, in this case zymosan, it can be followed using wide-field fluorescence microscopy, where cells are imaged as they phagocytose, and phagosomal pH changes are measured in real time as the phagosome matures. The actual pH is then gleaned by performing a calibration experiment where cells that have phagocytosed are exposed to solutions of different pH that contain the ionophores nigericin and monensin, that allow the rapid equilibration of the pH within phagosomes with the external solution. Ratio values are then compared to the known pH of solutions, a calibration curve is constructed by nonlinear regression and the resulting equation used to calculate pH from the ratio value.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymosan A powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4250</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Z2850</td>
			<td>Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-204107</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenyleneiodonium chloride (DPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2926</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanamycin A (ConcA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27689</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monensin</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-380-026-G001</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14200-075</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balance salt solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Ringer&#39;s balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671&#160;</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004&#160;</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503&#160;</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2860</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>Ibidi &#181;-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath</td>
			<td>O. Kleiner AG</td>
			<td></td>
			<td>A sonicator may be used instead, various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamocytometer</td>
			<td>Marienfeld GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield live imaging microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Dynamax RP-1)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Schott Gerate GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Counter</td>
			<td>Milian SA</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagosome ph by ratiometric fluorescence microscopy

Fagocitosi è un processo fondamentale attraverso il quale le cellule immunitarie innate fagocitare batteri, cellule apoptotiche o altre particelle estranee al fine di uccidere o neutralizzare il materiale ingerito, o di presentarlo come antigeni e di avviare le risposte immunitarie adattive. Il pH di fagosomi è un parametro critico regolazione fissione o fusione con endomembrane e l&#39;attivazione degli enzimi proteolitici, eventi che permettono al vacuolo fagocitosi di maturare in un organello degradativa. Inoltre, è richiesto di traslocazione H + per la produzione di elevati livelli di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS), che sono essenziali per l&#39;uccisione efficiente e segnalazione ad altri tessuti dell&#39;ospite. Molti patogeni intracellulari sovvertono uccisione fagocitico limitando phagosomal acidificazione, sottolineando l&#39;importanza del pH in phagosome biologia. Qui si descrive un metodo per misurare raziometrica phagosomal pH nei neutrofili con fluoresceina isotiocianato (FITC) -labeled zymosan come phagocytic targETS e live-cell imaging. Il saggio si basa sulle proprietà di fluorescenza di FITC, che si spegne da pH acido quando eccitato a 490 nm ma non quando eccitato a 440 nm, permettendo la quantificazione di un rapporto pH-dipendente, piuttosto che di fluorescenza assoluta, di un singolo colorante. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l&#39;esecuzione in loco di calibrazione tintura e la conversione del rapporto di valori reali di pH. Single-dye metodi raziometriche sono generalmente considerati superiori a singola lunghezza d&#39;onda o protocolli pseudo-raziometrico dual-dye, in quanto sono meno sensibili alle perturbazioni, come lo sbiancamento, concentrarsi modifiche, variazioni laser, e l&#39;etichettatura irregolare, che distorcono il segnale misurato. Questo metodo può essere facilmente modificato per misurare il pH in altri tipi di cellule fagocitiche e zymosan può essere sostituita da qualsiasi altra particella contenente ammina, da perline inerti ai microrganismi viventi. Infine, questo metodo può essere adattato a fare uso di altre sonde fluorescenti sensibili a diversi intervalli di pH o altri phagosomattività al, rendendolo un protocollo generale per l&#39;imaging funzionale di fagosomi.

Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi per un esperimento in cui il pH phagosomal dei neutrofili topo primari isolati dal midollo osseo di wild-type o Hvcn1 - / - sono stati confrontati topi. Per un esperimento riuscito, è importante ottenere abbastanza fagosomi all&#39;interno del campo visivo durante tutta la durata del film accelerato, evitando troppi fagosomi, che sarà poi essere più difficile segmento durante l&#39;analisi delle immagini. La figura 1 mostra</...

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Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K Views.  University of Geneva. Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy. 