Questo protocollo consente all'utente di studiare l'impatto delle procedure chirurgiche invasive utilizzate in clinica sui comportamenti delle cellule tumorali, come la migrazione, l'invasione e la proliferazione. Questo metodo consente in modo univoco la visualizzazione dello stesso tumore prima e dopo una procedura invasiva, fornendo un'intuizione che potrebbe essere persa in un approccio non longitudinale. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al dito del piedi in un topo adulto anestetizzato, montare il mouse su un telaio stereotattico e fissare la testa con un morsetto del naso e due auricolari.
Utilizzare una lampada riscaldante per preservare la temperatura corporea e applicare un unguento agli occhi dell'animale. Usando forbici affilate, radere la pelliccia sul cranio dagli occhi alla base del cranio e utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare la pelle esposta. Tagliare la pelle in modo circolare e utilizzare un batuffolo di cotone per raschiare via il periosteo esposto.
Trattare l'area chirurgica con una goccia di 1%lidocaina e una concentrazione di 1:100.000 di epinefrina per cinque minuti prima di rimuovere la soluzione in eccesso con un batuffolo di cotone. Utilizzare la colla cianoacrilato per aderire ai bordi della pelle al cranio e posizionare il telaio stereotattico sotto un microscopio stereo a dissezione con un ingrandimento 4x. Quindi, perforare con cura una scanalatura superficiale di cinque millimetri, circolare sull'osso parietale destro.
E applicare una goccia di tampone di corteccia alla scanalatura. Utilizzare forcep sottili per sollevare il lembo osseo per visualizzare la superficie cerebrale e utilizzare forcep curve, affusolata e molto fine per rimuovere il dura mater. Se si verifica sanguinamento, utilizzare una spugna di gelatina assorbibile per ottenere l'emostasi.
Per l'iniezione di cellule tumorali, caricare circa tre microlitri delle cellule in una siringa a tenuta di gas a cinque microlitri dotata di un ago a due punti. Fissare l'ago sul braccio manipolatore stereotassico e rimuovere il tampone della corteccia dal tessuto esposto. Posizionare la punta della siringa al centro della craniotomia e inserire l'ago a una profondità di 0,5 millimetri dalla superficie del cranio.
Quindi, aggiungere una goccia di tampone di corteccia alla craniotomia e utilizzare un iniettore di pompa microsiringa per consegnare le cellule a una velocità da 250 a 400 nanoliter al minuto. Per preparare la finestra di imaging cranica, sostituire il tampone della corteccia con una goccia di olio di silicone nel sito di craniotomia per evitare bolle d'aria sotto la finestra. Sigillare il cervello esposto con un coverslip di sei millimetri e applicare la colla cianoacrilato tra il coverslip e il cranio.
Quindi utilizzare una pinzetta fine per premere delicatamente la coverlip contro il cranio. Nel punto di tempo sperimentale appropriato, posizionare il mouse a faccia in su in una casella di imaging e impostare l'obiettivo 25x acqua sulla posizione z più bassa. Aggiungere una grande goccia d'acqua all'obiettivo e trasferire la scatola di imaging nella camera climatica scura di 37 gradi Celsius del microscopio.
Porta l'obiettivo sul coperchio della finestra di imaging cranici fino a quando la goccia d'acqua tocca il coverslip. E usando la modalità di epifluorescenza, osserva il tumore attraverso l'oculare per mettere a fuoco le cellule. Sintonizzare il laser sulla lunghezza d'onda corretta e selezionare la modalità live.
Dopo aver selezionato diverse posizioni di interesse per l'imaging, registrare le loro coordinate nel software. Definire uno z-stack per ogni posizione per acquisire il massimo volume di cellule tumorali senza compromettere la risoluzione delle cellule tumorali, con la dimensione del passo tra le immagini impostata su tre micrometri. Quindi, acquisire immagini del volume tumorale in posizioni diverse ogni 20 minuti per due ore, aggiungendo acqua all'obiettivo prima di ogni acquisizione di immagini.
Dopo aver acquisito l'ultima immagine, trasferire il mouse su una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino al pieno recupero. Un giorno dopo la prima sessione di imaging, fissare il mouse anestetizzato nel telaio stereotassico come dimostrato e utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di acetone per pulire i bordi del coperchio fino a quando la colla non viene ammorbidita. Far scorrere un ago calibro 25 sotto il coverslip e utilizzare pini a punto sottile per sollevarlo e idratare la craniotomia con tampone fresco della corteccia.
Forare il tumore a una profondità di un millimetro con un ago calibro 25, fermando qualsiasi sanguinamento con una spugna di gelatina sterile e sigillare la superficie del cervello con olio di silicone fresco. Quindi incollare un nuovo coverslip di sei millimetri sulla ferita. Per l'analisi delle immagini, aprire il file LIF time-lapse nel programma software al microscopio e selezionare la scheda Processo, Strumenti processo e Unisci.
Selezionare la prima immagine della sequenza di tempo e fare clic per primo. Selezionare la seconda immagine della sequenza di tempo e fare clic su seconda. In Unisci quote selezionare t per il tempo, quindi fare clic su applica.
Verrà generato un nuovo file con due punti di tempo. Dopo aver tracciato separatamente ogni serie time-lapse per tre z-stack consecutivi, trascinate la cartella contenente le immagini time-lapse su ImageJ. Selezionate la scheda Plugin, Tracking e MtrackJ.
Per tenere traccia di ogni singola cella, selezionare Aggiungi e fare clic su ogni cella in ogni punto di tempo. Quindi fare clic su misura e salvare il file per estrarre la misura delle tracce. La migrazione delle singole cellule tumorali può essere determinata monitorando il percorso di migrazione nel tempo in diversi piani xy della pila z e tracciata come percentuale delle cellule migratrici pre e post biopsia.
Il tasso di proliferazione delle cellule tumorali può essere quantificato in base alla condensazione di Dendra2 taggata da H2B sulla mitosi e tracciato come percentuale delle cellule divisorie pre e post biopsia. Confrontando la distribuzione della velocità di migrazione prima e dopo la biopsia nello stesso tumore, rivela che il numero di cellule migratorie aumenta dopo l'intervento, con una diminuzione associata del numero di cellule lente a non migratorie. In media per tumore, si osserva un aumento di 1,75 volte della percentuale di cellule migratrici quando viene eseguita una lesione simile alla biopsia, rispetto al controllo, dei topi non biopsiati.
Sebbene la percentuale di cellule tumorali migratorie alla fine diminuisca sia nei topi di controllo che in quelli biopsiati, i topi biopsiati mostrano ancora una maggiore capacità migratoria rispetto ai topi di controllo in generale. Il comportamento proliferatore delle cellule tumorali dimostra anche un aumento di 1,52 volte del numero di eventi mitotici sulla biopsia nel tempo, rispetto ai topi di controllo non biopsiati. Da notare che non si osserva alcuna induzione della migrazione o della proliferazione delle cellule tumorali dopo la sostituzione della finestra di imaging cranico senza biopsia, indicando che l'aumento della proliferazione delle cellule tumorali e dei tassi di migrazione è specificamente innescato dalla lesione simile alla biopsia.
È importante lavorare con alta precisione e abilità chirurgica durante le fasi di imaging cranici, impianto e sostituzione. Può essere necessaria una pratica estensiva.
